【佳學基因檢測】關(guān)于非小細胞肺癌小樣本生物標志物基因檢測的分析、報告和質(zhì)量評估

基因檢測報告的分析、報告和質(zhì)量評估導讀

非小細胞肺癌 (NSCLC) 的診斷工作需要生物標志物測試來指導治療選擇。本文是由兩部分組成的系列文章中的第二篇。在第 1 部分中，非小細胞肺癌基因檢測正確性如何才能達到最高課題組總結(jié)了獲取和處理晚期非小細胞肺癌患者的小樣本樣本（即分析前步驟）的循證建議。在第 2 部分中，非小細胞肺癌基因檢測正確性如何才能達到最高課題組總結(jié)了與非小細胞肺癌中小樣本樣本的生物標志物檢測（以及相關(guān)的報告和質(zhì)量評估）的分析步驟相關(guān)的循證建議。隨著可操作（遺傳）靶點和已批準靶向治療的生物標志物數(shù)量不斷增加，使用下一代測序（NGS）同時測試多個可操作致癌驅(qū)動因素變得勢在必行，正如歐洲醫(yī)學腫瘤學會指南所述。這在晚期非小細胞肺癌中尤為重要，在晚期 NSCLC 中，組織標本通常有限，與序貫生物標志物檢測相比，NGS 可能有助于避免組織衰竭。盡管有指南建議，但在獲得新一代測序技術(shù)方面存在顯著差異，這主要是由于報銷限制。使用越來越復雜的測試方法也對結(jié)果報告產(chǎn)生影響。分子檢測報告應包括臨床解釋，并酌情對樣本充分性進行附加評論。建議使用分子腫瘤委員會來促進對高通量測序基因檢測產(chǎn)生的復雜遺傳信息的解釋，并共同確定非小細胞肺癌患者的最佳治療方案。最后，無論采用哪種測試方式，

關(guān)鍵詞： 外部質(zhì)量評估，液體活檢，分子診斷，二代測序，非小細胞肺癌

非小細胞肺癌基因檢測介紹

非小細胞肺癌基因檢測正確性如何才能達到最高課題組應該測試誰？

生物標志物檢測現(xiàn)在對于指導晚期非小細胞肺癌 (NSCLC) 的治療決策至關(guān)重要，歐洲醫(yī)學腫瘤學會 (ESMO) 指南建議“所有患有晚期、可能、很可能或確定的腺癌的患者都應該接受檢測致癌驅(qū)動因素”。此外，建議對年齡小于 50 歲的非腺癌組織學（例如鱗狀細胞癌）患者進行分子檢測  以及從不吸煙者、長期戒煙者或輕度吸煙者（< 15 包年）。該策略是由找到可操作更改的相對概率驅(qū)動的。如第 1 部分 ，越來越多的證據(jù)表明，與接受化療的沒有可操作驅(qū)動突變的患者相比，接受靶向治療的具有可操作致癌驅(qū)動突變的患者臨床結(jié)果有所改善。

非小細胞肺癌基因檢測正確性如何才能達到最高課題組應該測試哪些生物標志物？

晚期非小細胞肺癌的臨床設備目前包括 7 個歐洲藥品管理局 (EMA) 批準的具有相關(guān)生物標志物的靶向藥物（不包括程序性死亡配體 1 [PD-L1]；見表???1) 。這些可操作遺傳靶點的生物標志物現(xiàn)在包括表皮生長因子受體 ( EGFR )外顯子 18、19 和 21 的致敏突變、Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物 ( KRAS ) p.G12C點突變、B-Raf 原癌基因 V600E點突變 ( BRAF p.V600E )，以及涉及間變性淋巴瘤激酶 ( ALK )、ROS 原癌基因 1 ( ROS1)、神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸受體激酶 (NTRK1、2 和 3 )的重排，并在轉(zhuǎn)染過程中重排 ( RET ) 。正如 ESMO 指南中所述，目前大多數(shù)歐洲國家都認為檢測EGFR突變和重排涉及ALK和ROS1是強制性的 。隨著一線 B-Raf/絲裂原活化蛋白激酶 (MEK) 抑制劑得到更廣泛的批準，許多腫瘤學服務也強制要求進行BRAF p.V600E突變檢測 。在歐盟委員會于 2022 年 1 月批準 sotorasib 后， KRAS p.G12C現(xiàn)在成為歐洲可行的遺傳靶點 。NTRK是許多歐洲國家批準治療的靶點，而 Erb-B2 受體酪氨酸激酶 2/人表皮生長因子受體 2 ( ERBB2/HER2 ) 和肝細胞生長因子受體 ( MET ) 外顯子 14 跳躍突變是不斷發(fā)展的靶點/生物標志物。ESMO 正確醫(yī)學工作組制定了 ESMO 分子靶點臨床可操作性量表 (ESCAT)，以幫助臨床醫(yī)生優(yōu)先考慮各種遺傳靶點的可操作性 。ESCAT I 級改變意味著藥物已在臨床試驗中得到驗證，因此，改變應推動日常臨床實踐中的治療決策。ESMO 建議使用下一代測序 (NGS) 對肺腺癌患者的所有 I 級改變進行分析。

表格1:歐洲已建立和新興的非小細胞肺癌生物標志物

表格改編自 Kerr 等人。版權(quán)所有 © 2021 作者。由 Elsevier BV 出版 保留所有權(quán)利。根據(jù)知識共享署名 4.0 國際 (CC BY 4.0) 許可條款復制

ALK間變性淋巴瘤激酶，BRAF  B-Raf 原癌基因，EGFR 表皮生長因子受體，EMA 歐洲藥品管理局，ERBB2  Erb-B2 受體酪氨酸激酶 2，FDA 食品和藥物管理局，FGFR1 成纖維細胞生長因子受體-1，FISH 熒光原位雜交，HER2 人表皮生長因子受體 2，IHC 免疫組織化學，KRAS  Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，MEK 絲裂原活化蛋白激酶，MET 肝細胞生長因子受體，NGS新一代測序，NRG1 neuregulin-1，NSCLC非小細胞肺癌，NTRK神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸受體激酶，PD-L1 程序性細胞死亡配體 1， 轉(zhuǎn)染過程中重排的RET ， ROS1  ROS 原癌基因 1，PCR 聚合酶鏈反應，TPS 腫瘤比例評分

^a預測對酪氨酸激酶抑制劑靶向治療的反應

^b預測有/無 MEK 抑制劑對 BRAF 的反應

^c預測對免疫療法的反應

^d作為預測性生物標志物正在研究中，目的是為患者確定合適的治療方法

^e在超過三分之一的案例中沒有特定的驅(qū)動程序已知

^f外顯子 19 缺失、外顯子 21 p.L858R突變和外顯子 20 插入分別約占所有突變的 10%、6% 和 2.5%

^g新興技術(shù)

^h截至 2022 年 1 月

ⁱ其他直接 KRAS。^G12C抑制劑正在研發(fā)中，包括 adagrasib（MRTX849；FDA 突破性療法指定）、GDC-6036、JNJ-74699157、JDQ443、LY3537982、D-1553

^j FDA 批準

^k在日本獲得批準

^l正在接受EMA審核

^m根據(jù)早期獲得藥物計劃在英國獲得批準

除了可操作的遺傳靶標的生物標志物外，免疫組織化學 (IHC) 的 PD-L1 表達對于通知免疫檢查點抑制劑的治療選擇是必不可少的（表???（表格1）1) 。ESMO 指南規(guī)定了一線治療中腫瘤比例評分≥50% 的強制性閾值 ；腫瘤比例評分定義為PD-L1+腫瘤細胞數(shù)除以存活腫瘤細胞總數(shù)，再乘以100% 。然而，生物標志物分析的定義和閾值沒有標準化；對于 PD-L1，至少有五種檢測方法可用，它們具有特定的評分系統(tǒng)和腫瘤部位適應癥 。研究表明，其中一些針對非小細胞肺癌的檢測結(jié)果高度一致 。然而，新興生物標志物的檢測標準化是一項挑戰(zhàn)，需要所有利益相關(guān)者共同努力，以確保生物標志物引導的靶向治療在未來取得成功。

由于有豐富的靶向治療藥物，EMA 批準的可操作靶標生物標志物的數(shù)量將在未來幾年增加。這些包括MET外顯子 14 跳躍突變和基因擴增、ERBB2/HER2突變和擴增、neuregulin-1 ( NRG1 ) 重排、成纖維細胞生長因子受體 1 ( FGFR1 ) 和EGFR外顯子 20 插入 。針對這些基因的藥物正在研究中，其中一些已經(jīng)在某些國家獲得批準（見表???表格11）。

靶向藥物開發(fā)的快速創(chuàng)新步伐體現(xiàn)在非小細胞肺癌正確腫瘤學的當前和未來狀態(tài)，這使得臨床指南和相關(guān)實踐難以跟上步伐。數(shù)字 1表明當前建議與主要國際生物標志物測試指南中批準的療法之間的差距越來越大。

圖1：國際指南對a和b新興生物標志物的建議摘要 。圖改編自 Kerr 等人。版權(quán)所有 © 2021 作者。由 Elsevier BV 出版 保留所有權(quán)利。根據(jù)知識共享署名 4.0 國際 (CC BY 4.0) 許可條款復制。^a NCCN 腫瘤學臨床實踐指南（NCCN 指南^®）為某些應測試的個別生物標志物提供建議，并推薦測試技術(shù)，但不承認任何特定的商業(yè)上可用的生物標志物測定或商業(yè)實驗室，^b生物標志物檢測^{NCCN 指南®}推薦KRAS和RET，^c NCCN 指南^®不推薦 TMB 檢測。ALK 間變性淋巴瘤激酶，AMP 分子病理學協(xié)會，ASCO 美國臨床腫瘤學會，BRAF B-Raf 原癌基因，CAP 美國病理學家學院，EGFR 表皮生長因子受體，ERBB2  Erb-B2 受體酪氨酸激酶 2，ESMO 歐洲學會用于內(nèi)科腫瘤學，HER2 人表皮生長因子受體 2，IASLC 國際肺癌研究協(xié)會，IHC 免疫組化，KRAS  Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，MET 肝細胞生長因子受體，NCCN 國家綜合癌癥網(wǎng)絡，NTRK 神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸受體激酶，PD-L1 程序性細胞死亡配體 1，RET 重排期間轉(zhuǎn)染，ROS1 ROS原癌基因1，TMB 腫瘤突變負荷

國家指南和報銷決定的變化進一步擴大了現(xiàn)實世界實踐和技術(shù)創(chuàng)新之間的差距，這在時間和結(jié)果方面通常與最初的 EMA 批準有很大不同。Kerr 及其同事最近的一篇綜述 說明了歐洲國家之間在現(xiàn)實世界生物標志物測試實踐方面的顯著差異（圖 2）。，強調(diào)在某些地區(qū)和國家對非小細胞肺癌患者進行生物標志物檢測的情況仍然不理想。

圖 2：晚期或反復性非小細胞肺癌生物標志物檢測的國家特定指南摘要 。圖改編自 Kerr 等人。版權(quán)所有 © 2021 作者。由 Elsevier BV 出版 保留所有權(quán)利。根據(jù)知識共享署名 4.0 國際 (CC BY 4.0) 許可條款復制。ALK 間變性淋巴瘤激酶，BRAF  B-Raf 原癌基因，EGFR 表皮生長因子受體，ERBB2  Erb-B2 受體酪氨酸激酶 2，HER2 人表皮生長因子受體 2，KRAS  Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，MET 肝細胞生長因子受體，新一代測序 新一代測序，NRG1  neuregulin-1，NSCLC 非小細胞肺癌，NTRK 神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸受體激酶，O可選，P先進，PD-L1 程序性細胞死亡配體 1，RET 轉(zhuǎn)染過程中重排，ROS1  ROS 原癌基因 1 , TMB腫瘤突變負荷。NTRK在有限的情況下也通過了測試^；在英格蘭，可以通過癌癥藥物基金獲得針對其他生物標志物的一些靶向療法。^b考慮其他分子檢測，具體取決于臨床或藥物可用性。^c NTRK、KRAS、MET、RET和ERBB2 / HER2將包含在當前版本中。^d目前未指出將這些生物標志物用作單獨的測試；相反，建議將它們包括在最初在所有晚期非小細胞肺癌中進行的擴展面板中，或者在之前的EGFR / ALK / ROS1 / BRAF測試為陰性時進行。^e如果患者無法進行活檢或組織分子分析結(jié)果無法提供信息，建議進行液體活檢測試。^f EGFR液體活檢僅在無法進行組織活檢時進行評估。^g對不符合反射標準的病例進行按需檢測（例如，對于具有一些提示性臨床特征的鱗癌[年輕、不吸煙等]）

非小細胞肺癌基因檢測正確性如何才能達到最高課題組應該如何評估非小細胞肺癌中的生物標志物？

7 種 EMA 批準的生物標志物導向非小細胞肺癌療法（不包括檢查點抑制劑）和新興靶向療法的可用性表明，將多重、大規(guī)模并行測序技術(shù)（即 NGS）作為治療患有晚期非小細胞肺癌。NGS 能夠同時測試多個致癌驅(qū)動因素 ，并提供一種方法來應對越來越多的可操作目標和有限的可用組織量（如第 1 部分所述）。NGS 可以分析臨床相關(guān)的共突變，例如絲氨酸/蘇氨酸激酶 11 ( STK11 )、kelch 樣 ECH 相關(guān)蛋白 1 ( KEAP1 ) 和腫瘤蛋白 p53 (TP53 ) 和涉及 1/2 型乳腺癌 ( BRCA1/2 )的 DNA 損傷反應途徑改變。其他新出現(xiàn)的新抗原負荷和免疫治療反應預測因子，如腫瘤突變負荷 (TMB)、綜合基因組分析 (CGP) 和 DNA 甲基化，也可以通過高通量測序基因檢測進行分析。隨著可評估生物標志物的數(shù)量不斷增加，并行或順序運行多個獨立檢測在時間和成本方面變得越來越低效，最終使天平向有利于新一代測序技術(shù)的方向傾斜。因此，最近的 ESMO 指南指出，對于某些腫瘤類型（例如肺腺癌、卵巢癌、前列腺癌和膽管癌的 I 級改變），使用新一代測序技術(shù)進行分子檢測更可取，并且高通量測序基因檢測正迅速被采用作為識別具有致癌靶標的肺腺癌的標準方法 。然而，盡管目前有指南建議，但在歐洲 的高通量測序基因檢測訪問/使用方面仍存在顯著差異，其中報銷限制是采用生物標志物測試最佳實踐的關(guān)鍵限制。

在本系列的前一篇文章中，非小細胞肺癌基因檢測正確性如何才能達到最高課題組探討了與獲得足夠質(zhì)量的組織進行生物標志物測試相關(guān)的挑戰(zhàn)和基于證據(jù)的建議。在這篇綜述（第 2 部分）中，非小細胞肺癌基因檢測正確性如何才能達到最高課題組總結(jié)了與晚期非小細胞肺癌患者小樣本生物標志物檢測的分析、報告和質(zhì)量評估相關(guān)的循證建議。如果沒有指南或文獻明確描述最佳實踐，非小細胞肺癌基因檢測正確性如何才能達到最高課題組會根據(jù)作者組的經(jīng)驗報告非小細胞肺癌基因檢測正確性如何才能達到最高課題組對最佳實踐的建議。

生物標志物測試方法

單基因或多重方法？

生物標志物測試方法分為兩類：DNA 和/或 RNA 的單基因或多重測定（即新一代測序技術(shù)或多重聚合酶鏈反應 [PCR]）。單基因檢測方法包括通過實時定量 PCR (qPCR) 進行 DNA 測序、焦磷酸測序或桑格測序、通過逆轉(zhuǎn)錄酶 (RT)-PCR 進行 RNA 測序、通過 IHC 檢測細胞蛋白表達以及通過（熒光）原位雜交（[F]ISH）。適當?shù)脑\斷方式取決于感興趣的分子靶標，如表中所示???表 2。 涵蓋表中所有生物標志物的測試???表2，寬面板下一代測序技術(shù)測序比使用 IHC、FISH 和 PCR 組合的多個獨立生物標志物測試更具成本效益（承認 IHC 是目前唯一高效的 PD-L1 評估方法，是ALK的先進方法， FISH 證實了模棱兩可的結(jié)果）。與這一預期一致，研究表明，當需要測試多個靶標時，NGS 比單基因測試更具成本效益 ，并且與單基因測試相比，NGS 的使用增加與壽命延長相關(guān)- 晚期非小細胞肺癌患者獲得的年 ?？傮w而言，NGS 代表了單基因檢測的有效替代方案 。

表 2:針對當前和新興的非小細胞肺癌預測性生物標志物的推薦分析方法

ALK 間變性淋巴瘤激酶，BRAF B-Raf 原癌基因，  EGFR表皮生長因子受體，ERBB2 Erb-B2 受體酪氨酸激酶 2，FISH熒光原位雜交，HER2人表皮生長因子受體 2，IHC免疫組化，KRAS Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物MET肝細胞生長因子受體NGS二代測序NRG1 neuregulin-1 NSCLC非小細胞肺癌NTRK神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸受體激酶PCR聚合酶鏈反應，PD-L1程序性細胞死亡配體 1，轉(zhuǎn)染過程中RET重排， ROS1 ROS 原癌基因 1，SEQ測序

DNA還是RNA？

雖然目前基于 DNA 的高通量測序基因檢測在理論上可用于檢測致敏突變（點突變、缺失和插入）、拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)重排（基因融合），但依賴基于 DNA 的融合檢測存在錯誤風險當大的內(nèi)含子區(qū)域位于融合伙伴之間時，與缺失相關(guān)融合相關(guān)的負面影響 ?；?DNA 的新一代測序技術(shù)分析的靈敏度可能受到NTRK等基因內(nèi)含子區(qū)域大小的限制，因為斷點通常發(fā)生在大內(nèi)含子區(qū)域內(nèi) 。然而，就假陰性錯誤率而言，用于文庫制備的各種系統(tǒng)之間存在差異。與 DNA 相比，RNA 測序不受轉(zhuǎn)錄過程中剪接的內(nèi)含子區(qū)域的影響。因此，作者建議將基于 RNA 的高通量測序基因檢測與基于 DNA 的下一代測序技術(shù)并行使用，以幫助提高檢測基因融合的靈敏度。技術(shù)的選擇也很重要，因為混合捕獲分析和錨定多重技術(shù)允許更廣泛的融合分析，但比基于擴增子的方法需要更多的材料 。此外，基于 RNA 的新一代測序技術(shù)允許鑒定基因轉(zhuǎn)錄本，從而得出關(guān)于功能齊全的框內(nèi)基因融合的結(jié)論，以及基因融合伴侶的鑒定。就對可用組織的潛在影響而言，RNA 和 DNA 的一步共提取以及 DNA 和 RNA 的同時新一代測序技術(shù)可以幫助減少組織消耗。

IHC 在檢測基因融合方面有作用嗎？

應該承認，特別是在融合基因檢測的情況下，IHC 可以補充和/或替代測序或 FISH 檢測；然而，根據(jù)作者的經(jīng)驗，還應考慮這些方法的費用和組織消耗。有時，當由致癌融合基因驅(qū)動時，在腫瘤細胞中觀察到蛋白質(zhì)水平升高。通過 IHC 檢測基因產(chǎn)物過表達是評估非小細胞肺癌中ALK、ROS1和NTRK融合的有用篩選工具。這種方法在 ESMO 指南  中得到推薦，美國食品和藥物管理局已批準 Roche VENTANA ALK (D5F3) CDx IHC 測定作為 ALK 激酶抑制劑的主要治療確定測試。對于ROS1和NTRK IHC + 病例，必須通過另一種分子方法（例如 FISH、qPCR、NGS）進行確認 。對于RET融合，不建議將 IHC 作為篩查工具，因為已報告假陽性和假陰性病例 ?？傊?，結(jié)合 DNA/RNA NGS，使用經(jīng)過適當驗證的分析并由合格的操作人員處理，是一種高效且有效的方法，用于全面檢測晚期非小細胞肺癌中所有已批準和新興的生物標志物（不包括 IHC 檢測的 PD-L1）。在融合基因檢測方面，IHC 可能還有其他作用。IHC 可能適用于腫瘤細胞少或非腫瘤細胞污染高且高通量測序基因檢測失敗或不可行的樣本。在適當?shù)慕M織學背景下，強 IHC 染色可能在臨床上直接可行（例如對于 ALK 融合）或強烈指示融合基因（例如 ROS1 和 NTRK）的存在。也有證據(jù)表明該蛋白的存在（陽性 IHC）可能表明對治療有更大的臨床反應的可能性。，表明 IHC 可能與用于融合基因鑒定/檢測的分子方法互補。

組織活檢還是液體活檢？

通過液體活檢對血漿循環(huán)游離 DNA (cfDNA) 進行測序是基于組織的生物標志物檢測的補充方法，特別是當組織樣本不足以或不適合/不適合生物標志物檢測，或者無法安全地進行再活檢時。根據(jù)作者的經(jīng)驗，cfDNA 測序分析可以使用在室溫下儲存在乙二胺四乙酸 (EDTA) 管中的 6 mL 外周全血進行。理想情況下，在 EDTA 管中收集的血液需要在 3 小時內(nèi)離心（以減少 cfDNA 的降解和假陰性結(jié)果的風險），產(chǎn)生 3 mL 的血漿，隨后使用市售的試劑盒進行 cfDNA 提取。然后可以對提取的 DNA 應用各種測序方法，包括 qPCR、液滴數(shù)字 PCR 和高通量測序基因檢測。分析技術(shù)必須對檢測腫瘤特異性 cfDNA 非常敏感，這僅占總循環(huán) cfDNA 的一小部分。

雖然血漿最常用于液體活檢，但所有生物體液都可能代表用于檢測的腫瘤 DNA 來源；然而，關(guān)于在非小細胞肺癌的基因組表征中使用這些替代來源指導治療的數(shù)據(jù)有限。然而，有證據(jù)表明，在檢測非小細胞肺癌和軟腦膜轉(zhuǎn)移患者的基因組改變方面，腦脊液檢測可能比血漿更敏感 。也有人提出，血漿和尿液檢測的結(jié)合可以提高非小細胞肺癌中EGFR突變檢測的敏感性 。

液體活檢還可以克服與組織活檢相關(guān)的腫瘤異質(zhì)性取樣偏差和/或允許對腫瘤演變和對治療的反應進行縱向研究 。液體活檢的另一個優(yōu)點是避免了組織采集的侵入性程序 。然而，有人擔心過度依賴液體活檢可能會導致一些實驗室的組織病理學服務較差，而且該技術(shù)并非沒有限制。例如，在最佳分析前程序或一致驗證的閾值方面缺乏共識，以及報告指南的稀缺性。然而，關(guān)于液體活檢的新建議正在出現(xiàn) ，最值得注意的是國際肺癌研究協(xié)會 (IASLC) 于 2021 年發(fā)表的最新共識聲明（見圖 2）。此外，仍然存在假陰性的風險（敏感性約為 87%），因為并非所有腫瘤都會脫落足夠的 cfDNA 進行檢測，并且 cfDNA 測序無法區(qū)分激酶抑制劑治療疾病反復背景下的形態(tài)學轉(zhuǎn)變 。因此，cfDNA 分析的陰性結(jié)果應通過組織檢測（必要時包括組織重新活檢）來確認。作者認為，特異性問題可能是 cfDNA 中檢測到的新標記的另一個重要限制因素。與對非小細胞肺癌具有高度特異性的EGFR突變不同，其他突變，例如BRAF p.V600E，見于不同的人類惡性腫瘤。對于這些突變，液體活檢可以提供重要的額外信息來幫助決策，并可能導致識別出與預期不同的腫瘤或第二個腫瘤?？寺⌒栽煅部赡軐е峦庵苎毎蛔兊臄U大，如果液體活檢結(jié)果被誤解，可能會導致假陽性 。最后，挑戰(zhàn)限制了通過基于 RNA 的新一代測序技術(shù)進行基因融合分析的液體活檢。循環(huán)中可以發(fā)現(xiàn)無腫瘤細胞 RNA (cfRNA)，但由于分離程序問題和健康細胞的背景噪音問題，將 cfRNA 作為診斷工具進行評估的研究由于重現(xiàn)性和特異性差而受到阻礙。從血漿中保存、提取和測序細胞外 mRNA 的新策略可能有助于在未來克服這些障礙 。鑒于目前的局限性，建議盡可能進行基于組織的檢測，并應在每個實驗室建立組織利用和液體活檢的詳細方案，以評估預測性生物標志物 。

圖 3:液體活檢用于晚期/轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌的診斷算法（更新的 IASLC 共識聲明）。圖轉(zhuǎn)載自 , J Thorac Oncol, Vol. 16，Rolfo C 等人，晚期非小細胞肺癌的液體活檢：國際肺癌研究協(xié)會的共識聲明，第 1647-1622 頁。版權(quán)所有 (2021)，經(jīng) J Thorac Oncol 許可。由 Elsevier Ltd. 出版。保留所有權(quán)利。順序方法：組織后繼 cfDNA 互補方法，同時組織和 cfDNA，血漿優(yōu)先方法，cfDNA 先。cfDNA游離 DNA，IASLC國際肺癌研究協(xié)會，NSCLC非小細胞肺癌

細胞學標本結(jié)果解讀

細胞學樣本已被證明適用于肺癌患者的基因組分析 。然而，由于細胞結(jié)構(gòu)的視覺驗證并不總是可能的，根據(jù)作者的經(jīng)驗，在沒有檢測到變異的情況下，應考慮潛在的假陰性結(jié)果。有幾個因素可能會限制來自細胞學樣本的生物標志物檢測的正確性，包括分析的潛在少量腫瘤細胞可能無法概括腫瘤異質(zhì)性、DNA/RNA 輸入量低以及腫瘤細胞與非轉(zhuǎn)化細胞的比例低。

報告生物標志物結(jié)果

正確報告生物標志物測試結(jié)果對于及時提供最佳治療至關(guān)重要，特別是考慮到越來越多的關(guān)注點是盡量縮短從轉(zhuǎn)診到專科護理到開始治療的時間 。然而，報告的復雜性隨著臨床相關(guān)生物標志物數(shù)量的增加而增加，并且需要標準化。盡管多標志物小組報告可能包括有關(guān)潛在有益治療類別的信息，但使用更大的小組可以識別意義未知的變體，從而可能使解釋復雜化 。ESCAT 排名可以幫助臨床醫(yī)生優(yōu)先考慮生物標志物測試，因此可以改善解釋 ?？傮w而言，已發(fā)現(xiàn)許多報告缺陷阻礙了對測試結(jié)果的解釋 。由于臨床醫(yī)生必須向患者傳達研究結(jié)果并最終負責選擇合適的靶向治療，因此 2020 年對腫瘤學家對基因組檢測的信心調(diào)查發(fā)現(xiàn)，他們對使用單基因檢測更有信心，而對使用多標志物的信心不足，這也許不足為奇。指導患者護理的小組測試 。

為了解決與報告分子病理學結(jié)果相關(guān)的日益復雜的問題，國際標準化組織 (ISO) 提出了關(guān)鍵報告標準。這些標準建議報告包括對結(jié)果的解釋，并附有警告或解釋性說明（在相關(guān)的地方）。作者認為，包含有關(guān)潛在局限性的信息可能與非小細胞肺癌中的小樣本生物標志物檢測特別相關(guān)，其中原始樣本的質(zhì)量或充分性可能會影響結(jié)果或解釋。在此基礎(chǔ)上，作者建議包括對診斷確定性的評論（即假陽性的可能性[例如存在意義不確定的變體或低等位基因頻率的變體]或假陰性結(jié)果[由于低細胞性]）。專家組關(guān)于非小細胞肺癌診斷程序的建議還提倡在實驗室報告中進行臨床解釋，特別是通過包含關(guān)于癌癥對特定類別藥物有反應或抵抗的可能性的聲明 。為支持這些建議，最近對非小細胞肺癌分子病理學請求表和報告中存在的成分進行的一項觀察性研究發(fā)現(xiàn)，病理學家和/或分子生物學家和臨床醫(yī)生認為最重要的報告項目是對檢測結(jié)果的臨床解釋；該研究還提出了便于完成報告的模板 。最近，Kerr 及其同事 也審查了報告標準，其建議見表???3.

表3：醫(yī)學實驗室的報告標準，改編自 ISO 15189，以及生物標志物測試的其他注意事項

表格改編自 Kerr 等人。版權(quán)所有 © 2021 作者。由 Elsevier BV 出版 保留所有權(quán)利。根據(jù)知識共享署名 4.0 國際 (CC BY 4.0) 許可條款復制

ISO國際標準化組織、MDTB多學科腫瘤委員會、MTB分子腫瘤委員會

^a在適用的情況下；各國在治療指導方面可能有所不同

^b適用時

正如 ISO 要求中所強調(diào)的那樣，對實驗室結(jié)果的完整解釋可能需要實驗室內(nèi)無法獲得的臨床背景 。在這些情況下，由來自不同臨床專業(yè)的醫(yī)療保健專業(yè)人員組成的多學科團隊是解釋復雜遺傳信息的基礎(chǔ)，并協(xié)同工作以確定個體患者的最佳臨床管理 ?；诖罅靠刹僮鞯耐蛔兒涂捎玫陌邢蛑委?，NSCLC 患者的臨床決策可能特別具有挑戰(zhàn)性。在許多國家，由來自不同專業(yè)的醫(yī)療保健專業(yè)人員組成的多學科腫瘤委員會 (MDTB) 對所有新診斷的非小細胞肺癌患者進行管理是強制性的；可能還需要分子腫瘤委員會 (MTB) 來討論具有罕見突變或復雜突變譜的復雜病例 。除了解釋與樣本質(zhì)量相關(guān)的分子發(fā)現(xiàn)（例如腫瘤含量和假陰性風險）之外，在組織診斷的整體背景下審查任何發(fā)現(xiàn)也很重要。罕見的腺癌亞型和合并組織學的腫瘤以及其他因素可能會影響或解釋不尋常的分子發(fā)現(xiàn)。

雖然獲得當?shù)?MDTB/MTB 被認為是必不可少的 ，但并非所有晚期非小細胞肺癌患者都能獲得從這些討論中獲得的建議。許多患者不需要討論（例如，確定了一種明顯的改變，例如EGFR突變或ALK融合）；因此，一些腫瘤學家仍然對 MDTB/MTB 的益處持懷疑態(tài)度 。一些 MTB 支持三級醫(yī)療中心和周邊醫(yī)院之間的區(qū)域合作，以增加患者人數(shù) 。MTB 也可以在國內(nèi)或國際上運營；例如，歐洲癌癥核心網(wǎng)絡  內(nèi)的七個歐洲癌癥中心建立了一個具有自動新一代測序技術(shù)數(shù)據(jù)解釋和報告功能的 MTB 門戶。最終，MDTB/MTB 的目標是為醫(yī)生提供針對個體患者的最佳和可用的個性化治療方案的建議。

由于預計在 COVID-19 大流行之后遠程醫(yī)療將繼續(xù)發(fā)展，因此應在適當情況下考慮實施虛擬 MDTB/MTB，因為它們可能有助于提高多學科護理的效率 。此外，為轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌患者實施臨床路徑可能支持臨床決策并幫助管理資源 。

外部質(zhì)量評估/控制

無論選擇何種測試方式，實驗室都必須進行充分的內(nèi)部和外部過程驗證和質(zhì)量評估 。在許多國家，參與外部質(zhì)量評估 (EQA) 計劃是強制性的，因為 EQA 提供客觀反饋，以最大限度地提高跨實驗室診斷測試的正確性和標準化 。

目前有多個國際和歐洲組織針對非小細胞肺癌開展 EQA 項目，表中總結(jié)了一些最大的項目???表 4。 EQA 提供者使用的測試樣品來源多種多樣，從人工福爾馬林固定石蠟包埋材料、工程人類細胞系（具有受控腫瘤細胞含量的均質(zhì)混合物）到真實人類腫瘤組織。后者最接近地反映了每個實驗室在現(xiàn)實環(huán)境中面臨的挑戰(zhàn)。在樣品分析之后，參與的實驗室會生成一份書面報告，至少在某些 EQA 項目中，該報告會發(fā)送給 EQA 提供者進行審查和評估。隨后，EQA 提供者會發(fā)布個人反饋報告，以幫助實驗室提高績效 。EQA 提供者可能會發(fā)布最成功參與者的實驗室協(xié)議作為最佳實踐的建議，從而幫助在結(jié)果不佳的實驗室中實施糾正措施。

表 4：歐洲最大的非小細胞肺癌 EQA 項目總結(jié)

ALK間變性淋巴瘤激酶，BRAF B-Raf 原癌基因，EGFR表皮生長因子受體，EQA外部質(zhì)量評估，ERBB2 Erb-B2 受體酪氨酸激酶 2，HER2人表皮生長因子受體 2，KRAS Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，MET肝細胞生長因子受體，NSCLC非小細胞肺癌，PD-L1程序性細胞死亡配體 1，PIK3CA磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 3-激酶催化亞基 α，轉(zhuǎn)染過程中重排的RET ， ROS1 ROS 原癌基因 1，SNV單核苷酸變體

EQA 有幾個限制。與正確醫(yī)學相關(guān)的日益增加的基因組復雜性排除了每個感興趣的診斷參數(shù)的 EQA；例如，樣品制備通常被排除在外 。因此，EQA 不能替代內(nèi)部質(zhì)量控制和適當參考材料的常規(guī)使用 。此外，參與 EQA 會產(chǎn)生相關(guān)成本，以及實驗室進行參與所需測試的資源成本。此外，如果每年測試多個樣品，測試成本可能會超過參與費。最近，幾個 EQA 提供商組織了 cfDNA 試點 EQA 計劃，例如 EMQN CIC、基因組質(zhì)量評估 (GenQA)、歐洲病理學會 (ESP) 基金會、Gen&Tiss 和 Qualitätssicherungs-Initiative Pathologie (QuIP)。此外，國際病理學質(zhì)量網(wǎng)絡 (IQN Path) 組織了一個協(xié)作 cfDNA 試點計劃（包括 ESP、Associazione Italiana di Oncologica Medica [AIOM]、EMQN CIC 和 GenQA）；結(jié)果于 2018 年發(fā)表 。該試點計劃證明了驗證 cfDNA 檢測方法的重要性，并建議實驗室審查其 EQA 結(jié)果以限制分析檢測錯誤的數(shù)量 并改進向轉(zhuǎn)診臨床醫(yī)生報告實驗室結(jié)果。

在采用和協(xié)調(diào)新型生物標志物時，EQA 計劃尤為重要。有強有力的證據(jù)表明 EQA 程序在提高患者的生物標志物檢測正確性方面發(fā)揮著重要作用（圖 1）。

圖 4:2012-2015 年歐洲病理學會運行的 EQA 計劃中EGFR、ALK和ROS1的肺癌生物標志物分析的錯誤率。圖改編自 Keppens 等人。版權(quán)所有 © 2021 作者。由影響期刊出版。版權(quán)所有。根據(jù)知識共享署名 3.0 國際 (CC BY 3.0) 許可條款復制。ALK 間變性淋巴瘤激酶、EGFR 表皮生長因子受體、EQA 外部質(zhì)量評估、FISH 熒光原位雜交、IHC 免疫組化、ROS1 ROS原癌基因1

診斷實驗室的 ISO 15189:2012 認證也反映了 EQA 的重要性，這需要參與 EQA 計劃 。在一些但不是所有國家，EQA 提供者可以直接將實驗室表現(xiàn)不佳的信息傳遞給有關(guān)當局（例如，英國皇家病理學家學院的國家質(zhì)量評估咨詢小組和比利時的 Sciensano）。

非小細胞肺癌基因檢測及其應用專家結(jié)論

鑒于肺癌中越來越多的生物標志物和相關(guān)的組織限制，預測性生物標志物的測試必須遵循最佳方法，以最大限度地提高有限組織樣本的診斷率。這導致從測試一個或多個單個標記的單基因方法過渡到以下一代測序技術(shù)為代表的多基因方法，后者更具成本效益（見表???5有關(guān)分析、報告和質(zhì)量評估的關(guān)鍵方面的關(guān)鍵意見和建議的摘要）。在可用于診斷/分子檢測的組織有限的情況下（PD-L1 除外，并且 IHC 是先進方法），單獨的高通量測序基因檢測檢測可能是合適的。同樣，基于血漿的 NGS（盡管存在敏感性/特異性問題）和基于組織的方法是互補的方法，因為對組織檢測結(jié)果的了解有助于解釋循環(huán) cfDNA 分析。無論使用何種測試方式，充分的內(nèi)部驗證和質(zhì)量控制方案都是至關(guān)重要的。參與 EQA 計劃有助于確?？鐚嶒炇覝y試的高水平正確性和標準化。最后，在 MDTB/MTB 的推動下，正確、詳細地報告并解釋測試結(jié)果，

表 5：圍繞分析、報告和質(zhì)量評估的關(guān)鍵方面的建議摘要

^a如果沒有指南或文獻明確描述最佳實踐，則根據(jù)作者組的經(jīng)驗報告最佳實踐建議

ALK間變性淋巴瘤激酶、  cfDNA游離 DNA、DNA脫氧核糖核酸、EQA外部質(zhì)量評估、ESCAT ESMO 分子靶標臨床可操作性量表、ESMO歐洲腫瘤內(nèi)科學會、EDTA乙二胺四乙酸、IHC免疫組化、NGS下一代測序、NSCLC非小細胞肺癌，NTRK神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸受體激酶，PD-L1程序性死亡配體 1，轉(zhuǎn)染過程中RET重排， RNA核糖核酸，ROS1 ROS 原癌基因 1

Expert opinion on NSCLC small specimen biomarker testing - Part 2: Analysis, reporting, and quality assessment.

Penault-Llorca F, Kerr KM, Garrido P, Thunnissen E, Dequeker E, Normanno N, Patton SJ, Fairley J, Kapp J, de Ridder D, Ryška A, Moch H.Virchows Arch. 2022 Jul 20:1-16. doi: 10.1007/s00428-022-03344-1. Online ahead of print.

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