2021-08-27發(fā)布2022-01-01實施

中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布前言

本標準由國家衛(wèi)生健康標準委員會臨床檢驗標準專業(yè)委員會負責技術審查和技術咨詢，由國家衛(wèi)生健康委醫(yī)管中心負責協(xié)調性和格式審查，由國家衛(wèi)生健康委醫(yī)政醫(yī)管局負責業(yè)務管理、法規(guī)司負責統(tǒng)籌管理。

本標準起草單位：北京醫(yī)院、北京市紅十字血液中心、中華骨髓庫管理中心、浙江省血液中心、遼寧省血液中心。

本標準主要起草人：蔡劍平、張志欣、肖堯、黑愛蓮、周曉陽、王琳、戴大鵬、張立群、朱發(fā)明、李劍平。

引言

人類白細胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）又稱移植抗原，與同種異體組織器官移植以及移植物的排斥反應相關。存在于細胞膜表面的HLA分子可以結合來自細胞內或細胞外的肽，形成HLA-肽復合物，抗原遞呈細胞將該復合物遞呈給T細胞引起一系列的免疫反應。

隨著對HLA研究的深入，20世紀中葉誕生的器官移植和造血干細胞移植技術已成為臨床醫(yī)學治療和拯救患者生命的重要手段，數以百萬計的患者通過器官移植和造血干細胞移植獲得了新生。近二十年來，隨著對免疫抑制劑、HLA配型、HLA抗體檢測和監(jiān)測等存活率影響因素的認識，器官移植和造血干細胞移植存活率得到了顯著的改善。HLA組織配型是影響器官移植和造血干細胞移植存活率及受者生存質量的重要因素之一。

HLA基因具有高度的多態(tài)性，決定了所表達的HLA抗原分子的多態(tài)性。隨著聚合酶鏈反應(polymerase chainreaction，PCR)技術在臨床應用的日益廣泛，從20世紀80年代末開始HLA分型已從過去主要采用血清學和細胞學檢測技術過渡到以基因分型檢測技術為主?；蚍中蜋z測技術具有靈敏度高、正確度高、能檢測出血清學和細胞學方法無法檢出的基因型別等優(yōu)點，還具有不排斥原有血清學和細胞學所闡述信息的優(yōu)點。HLA基因分型檢測技術對實驗室人員、實驗室設置、檢測的技術流程以及質量控制等提出了更高的要求。長期以來我國一直缺乏HLA基因分型檢測技術體系的規(guī)范及要求，在一定程度上影響了HLA基因分型整體檢測水平的提高和臨床器官移植、造血干細胞移植標準化的進程。

本標準擬建立適用于我國國情的HLA基因分型檢測技術體系的規(guī)范及要求，旨在提高我國HLA基因分型實驗室的技術水平，更有效地服務于與HLA相關的臨床診療工作。

人類白細胞抗原基因分型檢測體系技術標準

1范圍

本標準規(guī)定了HLA基因分型檢測體系的技術要求。

本標準適用于所有開展人體標本HLA基因分型檢測，提供與臨床疾病的診療、預防、用藥監(jiān)測或者移植以及人體健康評估相關報告的檢測實驗室，也適用于開展捐獻者HLA基因分型數據入庫的檢測實驗室和對HLA檢測進行質量控制的實驗室。

2規(guī)范性引用文件

本標準沒有規(guī)范性引用文件。

3術語和定義

下列術語和定義適用于本標準。

3.1

IPD-IMGT/HLA數據庫 Immuno-Polymorphism Database (IPD)- international ImMunoGeneTics project (IMGT)/HLA database

人類主要組織相容性復合物的 DNA序列數據庫，包含經世界衛(wèi)生組織 HLA命名委員會命名的 HLA等位基因序列。

1. 1. 3.2基于直接測序的基因分型 sequence based typing,SBT

       

   2. 基于核酸直接測序技術的基因分型方法。
   1. 3.3基于序列特異性引物的基因分型 sequence-specific primer,SSP

       

   2. 采用等位基因特異性引物進行核酸擴增的基因分型方法。
   1. 3.4基于序列特異性寡核苷酸雜交的基因分型 sequence-specific oligonucleotide,SSO

       

   2. 采用特異性序列的寡核苷酸進行核酸雜交的基因分型方法。
   1. 3.5基因型 genotype

       

   2. 某一基因或一組基因的具體等位基因組合。
   1. 3.6基因座 locus

       

   2. 基因在染色體上的位置，同一座位上可能有不同類型的等位基因；或一段DNA序列在染色體上的位置。
2. 3.7擦拭檢測 wipe test

    

是一種通過擦拭物體表面來監(jiān)測實驗室設備和臺面是否被核酸污染的檢測方法。

4環(huán)境和設施要求

1. 1環(huán)境

    

2. 1.1實驗室應有充足的空間，以便所有操作過程和檢測分析能夠正常運行，區(qū)域間應避免相互干擾。

    

3. 1.2實驗室檢測區(qū)域應分為“清潔區(qū)”和“污染區(qū)”，進行有效隔離并采取措施以防止核酸交叉污染。

    

4. 1.3應對實驗室環(huán)境溫度、濕度進行監(jiān)控并記錄。

    

5. 2設施

    

6. 2.1存放試劑和標本的冰箱或者冰柜應滿足實驗的需要。

    

7. 2.2照明和通風設備及緊急噴淋、洗眼器等應急設備應與實驗檢測要求相適應。

    

8. 2.3保存記錄的設施應滿足檔案管理要求。使用中的記錄和存檔記錄的保存位置清晰可辨且易于查找。

    

9. 2.4需要控制溫度的儀器應根據實驗要求調節(jié)到最佳溫度，定期對其溫度進行監(jiān)控和記錄。

    

10. 2.5關鍵儀器設備應配置無間斷電源。

     

11. 2.6設備應由經過授權的人員操作，專人管理。

     

12. 2.7設備及其軟件應有唯一性標識，并保存記錄。

     

13. 2.8儀器設備應定期進行維護保養(yǎng)，并保存維護、維修記錄。

     

14. 2.9應根據需求變化或硬件環(huán)境的變化對應用程序進行部分或全部的升級，并對升級后的軟件進行性能評估。依據 IPD-IMGT/HLA數據庫的更新，至少每年一次對本地 HLA數據庫進行更新，并針對更新后的數據庫進行性能評估。

     

15. 3生物、化學和物理危險性

     

    1. 3.1生物危險性

        

    2. 所有人類標本（包括血樣、組織等）均應被認作感染性的樣本來處置，實驗室應根據檢測工作進行相應的生物安全等級備案。
    1. 3.2化學危險性

        

    2. 分子生物學實驗過程可能使用含有毒性的或致突變的化學物質（如氯仿、溴化乙啶和苯酚），每一種化學品的使用應遵循我國對化學品使用的相關規(guī)定。
16. 3.3物理危險性

     

分子生物學實驗過程可能遇到具有潛在的物理危險性（如電泳儀、紫外線及離心設備），應遵循相應儀器的操作規(guī)則。

5試劑耗材的采購和儲存

1. 1通用要求

    

2. 1.1應制定并執(zhí)行檢測試劑、耗材的選擇、購買、接收和儲存的程序。

    

3. 1.2購買的檢測試劑、耗材，驗收合格后方可使用并保留驗收記錄。

    

4. 1.3應對影響檢測質量的關鍵耗材、試劑供應商進行評價，保存評價記錄和供應商名錄。

    

5. 2試劑耗材評估

    

6. 2.1選購影響檢測質量的關鍵耗材、試劑前應進行評估，產品質量應滿足實驗室檢測要求。

    

7. 2.2更換試劑和耗材的生產商應進行評估，產品質量應滿足實驗室檢測要求。

    

8. 2.3使用新批號試劑前，應對新、舊批號質量進行比對?？刹捎闷叫袡z測同一樣本或質控品的方式，新批號質量應滿足實驗室檢測要求。

    

9. 2.4影響檢測質量的關鍵耗材、試劑應確認合格，經實驗室主任或者授權人審批后才投入使用。

    

10. 3試劑的來源、制備及儲存

     

11. 3.1應記錄影響檢測質量的關鍵耗材和試劑的來源，包括制造商、供應商、購買日期、購買人、試劑批號等，且易于查詢。

     

12. 3.2所有檢測試劑應使用等級匹配的化學試劑配制，高效檢測試劑達到分子生物學等級水準。

     

13. 3.3應按照實驗室標準操作規(guī)程進行試劑配制，并進行記錄。

     

14. 3.4所有使用的試劑應清晰標記名稱、濃度、試劑特性、無菌狀態(tài)、試劑保存條件、配制人、配制日期或開啟日期、試劑有效期，并清晰標示試劑毒性。

     

15. 3.5所有使用的商業(yè)試劑的儲存標準應與制造商提供的說明書相一致。

     

16. 3.6商業(yè)或者自制的試劑、水、溶液、培養(yǎng)基、質控品、校準品及其他試劑，當超過使用效期、性質改變或質量下降時，不應使用。

     

17. 3.7使用商業(yè)試劑盒應遵循制造商的說明書。

     

    1. 3.8應記錄每次檢測使用試劑的批號或者貨號。

        

    2. 6樣本的采集和處理
18. 1患者或被檢測者信息

     

19. 1.1患者或被檢測者的送檢單信息內容應包括姓名、性別、出生日期（年齡）、采樣日期、樣本類型、送檢醫(yī)師姓名、臨床相關資料或實驗室檢查資料，可酌情調整內容。

     

20. 1.2樣本容器上應標注唯一性標識。

     

21. 1.3患者或被檢測者信息表、樣本、驗收記錄應歸檔保存，便于分析和追溯。

     

22. 1.4實驗室應確?；颊呋虮粰z測者信息的安全性和保密性。

     

23. 1.5患者或被檢測者的樣本被用于科研項目或商業(yè)項目時，應經過倫理審查和知情同意；如患者或被檢測者樣本僅進行臨床檢測，則無需填寫知情同意書。

     

24. 2樣本采集

     

25. 2.1樣本采集前應明確采集方法、采集部位和保存方式，準備好采集器械。采集樣本類型可為外周血、口腔拭子、骨髓細胞、唾液、組織。

     

26. 2.2樣本采集應按照實驗室操作標準進行操作，并進行記錄。

     

27. 2.3采集樣本時應注意影響樣本采集和質量的因素，外周血推薦使用 EDTA等抗凝劑，不宜使用肝素抗凝。

     

28. 2.4采集的樣本應具有唯一性標識，并與送檢單一一對應，可追溯患者姓名、出生日期、醫(yī)院編號或者實驗室編號、樣本采集日期和采集時間。

     

29. 3樣本運輸

     

30. 3.1樣本可以常溫或普通冰袋運輸，防止反復凍融和污染。

     

31. 3.2樣本應有運輸清單信息，包括樣本編號、采集時間、采集實驗室、采集人、樣本數量、患者信息、運輸容器、運輸方式和保存方式等。

     

32. 4樣本接收和驗收

     

33. 4.1接收樣本時，應做好接收驗收記錄，包括樣本來源、類型、運輸方法、運輸容器、實驗室接收樣本的日期、樣本質量和數量、附帶資料等。

     

34. 4.2當樣本信息不足、樣本處理或運輸不當、量不能滿足檢測、抗凝方式不當，實驗室可以拒收樣本并做好相應記錄，通知送檢方重新送檢。

     

35. 4.3驗收通過的樣本應按實驗要求進行編號并存儲樣本信息。

     

36. 4.4采集后的樣本可于 4℃暫存 2周，超出 2周宜在-20℃以下冰箱保存。樣本應避免反復凍融和相互污染，盡早提取核酸。

     

37. DNA提取、檢測和保存

     

38. 5.1樣本基因組 DNA提取

     

39. 5.1.1可從多種類型的樣本中提取基因組 DNA，提取方法應已獲得廣泛承認，并經實驗室驗證。

     

40. DNA時應記錄所有操作步驟及試劑來源，操作步驟及試劑來源的任何變動或實驗過程中的任何異?，F象也應記錄，操作人應簽字并注明實驗日期。

     

41. 5.1.3應設有獨立的 DNA提取操作區(qū)。操作區(qū)照明和通風設備應滿足實驗要求，關鍵設備配置無中斷或緊急電源，并利用物理或生化手段防止污染。區(qū)域內使用專用工作服、手套和一次性用品。

     

42. 5.1.4DNA提取前應驗證所有試劑質量以及 DNA提取系統(tǒng)。應按照標準操作規(guī)程提取 DNA，操作手冊置于便于取閱的地方。

     

43. 5.1.5應保留部分原始樣本，不應全部用來提取 DNA，以便后續(xù)追溯和使用。

     

44. 5.1.6DNA提取完成后應填寫提取記錄，包括樣本編號、提取時間、提取操作人、提取方式、樣本濃度和體積等。

     

45. 5.2DNA濃度的測定

     

46. 5.2.1對于要求高純度核酸的檢測方法，應對獲取的 DNA進行濃度和純度的檢測，可使用分光光度計法和電泳法。

     

47. 5.2.2分光光度計對 DNA濃度測定前應先校正，并設立合適的對照。DNA樣本被檢測時，應高效其全部溶解且濃度均勻。核酸最大吸收波長在 260 nm，1.0的光密度值相當于雙鏈 DNA含量為 50 μg/mL；蛋白質最大吸收波長在 280 nm處，因此測定 A260/A280比值，可判斷樣本中蛋白質和 RNA污染的情況。比值在 1.8～2.0之間，說明 DNA純度高；比值小于 1.6，說明樣本中蛋白質殘留較多；如果比值大于

     

1. RNA污染，建議重新抽提或純化。

    

2. 5.2.3電泳法常用來判斷 DNA的完整性和 RNA污染情況。

    

3. 5.2.4DNA濃度、純度和完整性應符合實驗室使用試劑的要求。若不符合后續(xù)檢測的要求，應重新抽提。

    

4. DNA的保存

    

基因組DNA可于4℃暫存2周，超出2周宜在-20℃以下冰箱保存。-20℃保存超過1年后再使用，應先進行DNA質量評估，滿足實驗要求方可使用。

7HLA基因分型檢測方法

1. 1聚合酶鏈反應-序列特異性引物（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）方法

    

   1. 1.1基本原理

       

   2. 根據HLA基因序列的多態(tài)性，設計一系列等位基因特異性引物，通過特定的PCR反應體系擴增各等位基因的特異性DNA片段，產生相對應的特異性擴增產物條帶，然后通過瓊脂糖 凝膠 電泳檢測PCR擴增產物，根據是否得到PCR產物以及產物的片段大小進行HLA基因分型。PCR-SSP的3′端引物和靶DNA特異性結合后，Taq酶使配對引物的3′端延伸，但非配對的不延伸，所以只有當靶DNA和上下游引物全部互補時才能有效擴增。PCR-SSP引物體系的特異性是通過上下游引物特異性之間的交叉來實現的。
2. 1.2檢測設備及引物設計

    

3. 1.2.1必需的設備（包括但不限于）：96孔 PCR板、專用貼膜；單通道移液器、多通道移液器；96孔或 384孔模塊 PCR儀；電泳系統(tǒng)及核酸片段分析系統(tǒng)。

    

4. PCR-SSP法的 HLA基因分型技術，關鍵是正確設計特異性的引物。該引物序列應與所檢測的 HLA等位基因序列相對應，宜使用商業(yè)試劑盒。

    

5. 1.2.3PCR引物和引物混合物宜分裝保存。

    

6. 1.3結果分析及問題解決方法

    

   1. 1.3.1總述

       

   2. 每個PCR-SSP反應，如果有內對照擴增，則該反應有效。如果一個反應既沒有內對照又沒有特異基因擴增條帶，則該反應失敗。如果一個反應沒有內對照擴增，即使這個等位基因在該反應里被擴增了，也被視為檢測失敗。等位基因的型別通過陽性和陰性反應的格局來判別。單孔反應失敗時，應重新進行PCR擴增反應。
7. 1.3.2常見問題的可能原因及解決方法

    

   1. 1.3.2.1無等位基因和無內對照片段擴增

       

      1. PCR儀的問題，可用確認的 DNA樣本對檢測試劑和 PCR儀進行驗證；

          

      2. b) DNA的質量不符合要求，當 DNA濃度太低，可以適當增加 DNA模板量，或增加 Taq酶量或兩者同時增加；

          

      3. c) Taq酶可能失效，更換 Taq酶。實驗室應正確存儲和使用 Taq酶。

          

   1. 1.3.2.2整體擴增條帶顯色強度弱

       

      1. a) PCR儀的問題，用確認的 DNA樣本檢測 PCR儀；

          

      2. b) DNA的質量不符合要求，參照 7.1.3.2.1 b)；

          

      3. c) Taq酶質量低或過度稀釋。應提高 Taq酶濃度，確保 Taq酶正確保存和使用。每個實驗應選擇合適的 Taq酶濃度；

          

      4. d) PCR相關試劑未正確保存、配制及使用，應確保每一步驟嚴格按照標準操作規(guī)程進行，必要時更換新的試劑。

          

   1. 1.3.2.3單一位點出現多個等位基因擴增條帶

       

      1. DNA受到污染，這種污染會在多個反應孔中產生額外條帶，可能出現兩種樣本的反應格局，應重新提取樣本 DNA；

          

      2. b) PCR產物污染，這種污染會在單個或少數檢測位點產生額外條帶，應使用新的試劑進行重新擴增；

          

      3. c) 可能是新的等位基因，應使用其他分子生物學方法進行確認。

          

   1. 1.3.2.4多個或所有位點出現多個等位基因擴增條帶

       

      1. DNA受到污染，這種污染大多數會在多個或所有基因位點的反應孔中產生額外條帶，可能出現兩種樣本的反應格局，應重新提取樣本 DNA；

          

      2. b) PCR儀加熱系統(tǒng)錯誤，如果 PCR程序被中斷或重啟（尤其是在早期階段），可以看到多條條帶，應對 PCR儀進行檢修和校準；

          

      3. PCR反應液受到污染，應重新采集樣本或配制新的試劑進行擴增檢測。

          

   1. 1.3.2.5一個基因位點上無特異性擴增條帶

       

      1. a) PCR反應液配制錯誤，應確保所有的 PCR反應組份在使用前經過驗證；

          

      2. dNTP（ 脫氧核糖核苷 三磷酸）與 MgCl 2的比#20363;不合適，可影響一個或更多基因位點的擴增，表現出在一個特殊的位點沒有等位基因，可調整 dNTP與 MgCl 2比例進行再次測試；

          

      3. c) 如果某些等位基因有較高的 G/C含量，可因 Taq酶選擇不當導致難以擴增。應更換合適的 Taq酶。

          

   1. 1.3.2.6有等位基因擴增條帶但無內對照條帶

       

      1. a) DNA降解，使分子量大的擴增條帶難以產生，如內對照無擴增條帶，應重新提取樣本 DNA；

          

      2. b) PCR延伸時間不足，應增加 PCR反應延伸時間；

          

      3. c) PCR儀故障，應重新校準 PCR儀；

          

      4. d) 內對照擴增引物濃度過低，應提高引物濃度。

          

   1. 1.3.2.7有內對照擴增條帶但無等位基因條帶

       

      1. a) 鎂離子濃度過高，應重新配制 PCR擴增試劑；

          

      2. b) PCR儀蓋壓力不夠，應確保 PCR儀蓋和 PCR管/板之間的壓力匹配。

          

   1. 1.3.2.8部分分型結果清晰，部分分型結果失敗

       

      1. a) PCR儀加熱系統(tǒng)故障，應確保 PCR儀加熱模塊的一致性；

          

      2. PCR儀加熱模塊不匹配，應確保 PCR管/板的底部直接接觸 PCR儀加熱模塊；

          

      3. c) PCR儀蓋壓力不均勻，應確保 PCR儀蓋和 PCR管/板之間的壓力匹配；

          

      4. d) 凝膠電泳時核酸染料沒有混合均勻或濃度不足，應重新配制凝膠或核酸染料溶液。

          

   1. 1.4檢測方法的局限性

       

   2. 基于已知序列信息的分型方法可能檢測不到新的等位基因，或者無法與已知等位基因相區(qū)別，為避免漏檢新的等位基因，當使用PCR-SSP方法時,可采用多種引物，以提高檢測到新等位基因的可能性。
8. -序列特異性寡核苷酸雜交（polymerase chain reaction-sequence specificoligonucleotide，PCR-SSO）方法

    

9. 2.1基本原理

    

PCR-SSO方法首先是對HLA的多態(tài)性區(qū)域進行擴增，然后根據 堿基配對 原則使用特異性探針進行雜交，根據雜交信號判斷結果?；赑CR-SSO技術的HLA分型方法主要包括正相SSO方法和反相SSO方法兩種。PCR-SSO技術具有 靈敏度 高、特異性強、加樣量少的特點。

2000年后基于流式熒光檢測儀Luminex平臺的PCR-SSO基因分型檢測系統(tǒng)開發(fā)成功，它利用 傳統(tǒng) PCR-SSO的原理，首先對樣本的HLA多態(tài)性區(qū)域進行擴增，擴增產物經解鏈后與 包被 在微珠上的特異性 探 針雜交結合，通過Luminex流式熒光檢測儀檢測，確定HLA分型結果。該系統(tǒng)是 整合 了熒光編碼微珠、激光檢測、應用流體力學、高速數字信號和計算機運算法等多項技術的高通量檢測平臺。7.2主要針對Luminex平臺的PCR-SSO HLA基因分型檢測技術進行說明和要求。

1. 1. 2.2必需的設備與耗材（包括但不限于）

       

   2. 96孔PCR板、96孔雜交板、96孔讀取板、專用貼膜，單通道移液器、多道移液器，96孔PCR儀、Luminex分析儀，平板離心機，電泳系統(tǒng)及成像系統(tǒng)。
2. 2.3PCR引物和雜交探針的設計

    

3. 2.3.1PCR擴增引物一般至少針對 HLA Ⅰ類基因（HLA-A, HLA-B,HLA-C）的 2號外顯子和 3號外顯子進行擴增，至少針對 HLA Ⅱ類基因（HLA-DRB1，HLA-DQB1）的 2號外顯子進行擴增。

    

4. PCR-SSO法的 HLA基因分型技術的關鍵是正確地設計特異性雜交探針，該探針序列應與所檢測的 HLA等位基因序列相匹配。

    

5. 2.3.3PCR引物應于-20℃保存,包被探針的微珠應避免反復凍融、劇烈震蕩，按廠家說明書要求條件保存。

    

6. 2.4結果分析及問題解決方法

    

   1. 2.4.1總述

       

   2. 對于每個PCR-SSO反應，如果內對照雜交信號達到閾值，可認為反應有效；如內對照和特異等位基因雜交信號均未達到閾值，可認為反應失??；如內對照雜交信號未達到閾值，即使特異等位基因雜交信號達到閾值，也認為反應失敗。
7. 2.4.2常見問題可能原因及解決方法

    

   1. 2.4.2.1擴增反應失?。娪撅@示無擴增條帶）

       

      1. PCR儀的問題，用確認的 DNA樣本對檢測試劑和 PCR儀進行驗證；

          

      2. b) DNA的質量不符合要求，DNA濃度太低，可以適當增加 DNA模板量，或增加 Taq酶量或兩者同時增加，如果凝膠成像顯示 DNA條帶正常，可能是 DNA純度差的原因，需要重新提取 DNA。

          

   1. 2.4.2.2微珠讀取數量未達到閾值

       

      1. a) Luminex儀器進樣針堵塞，應對儀器進行檢修；

          

      2. b) 微珠混合不均勻，應確保每一步驟嚴格按照標準操作規(guī)程進行；

          

      3. c) 微珠的保存條件不正確，應按廠家說明書要求進行保存。

          

   1. 2.4.2.3雜交熒光信號出現假陰性或未達到閾值

       

      1. a) PCR反應擴增失敗或擴增反應弱，應參照 7.2.4.2.1的解釋；

          

      2. Luminex儀器的問題，用確認的 DNA樣本對檢測試劑和 Luminex儀器進行驗證；

          

      3. c) 雜交試劑的保存、配制以及雜交后洗滌條件不當，應確保每一步驟嚴格按照標準操作規(guī)程進行。

          

   1. 2.4.2.4雜交熒光信號出現假陽性

       

      1. a) DNA純度和濃度沒有達到要求，應參照 7.2.4.2.1 b)的解釋；

          

      2. b) PCR擴增反應中 Taq酶過量，應確保每一步驟嚴格按照標準操作規(guī)程進行；

          

      3. Luminex儀器的問題，用確認的 DNA樣本對檢測試劑和 Luminex儀器進行驗證；

          

      4. d) 雜交過程中未充分混勻、孵育時間過長、熒光染料過量、洗板后孔內上清殘留過多，應確保每一步驟嚴格按照標準操作規(guī)程進行。

          

   1. 2.5檢測方法的局限性

       

   2. 基于已知序列信息的分型方法可能檢測不到新的等位基因，或者無法與已知等位基因相區(qū)別，為避免漏檢新的等位基因，當使用PCR-SSO方法時,可以加大探針的種類和數量，以提高檢測到潛在的新的等位基因的可能性。
8. 3基于直接測序法（sequence-based typing,SBT）

    

   1. 3.1基本原理

       

   2. 基于SBT的HLA基因分型檢測是對DNA序列進行直接測序，通過與國際HLA數據庫比對分析，獲得HLA等位基因型別的分析方法。任何DNA直接序列測定的方法均可用于HLA基因分型檢測，該方法是最高效的HLA基因分型方法，可正確確定新的HLA等位基因。
   1. 3.2必需的設備（包括但不限于）

       

   2. PCR儀、DNA測序儀、HLA基因分型軟件、計算機系統(tǒng)。
9. 3.3PCR擴增引物及測序引物的設計

    

10. 3.3.1PCR擴增引物一般針對 HLA Ⅰ類基因和 HLA Ⅱ類基因的各外顯子進行擴增，宜使用商業(yè)試劑盒。

     

11. 3.3.2測序引物一般根據擴增產物的區(qū)域決定，可使用商業(yè)試劑盒。

     

12. 3.3.3引物和測序試劑應分裝保存。

     

13. 3.4結果分析及問題的解決方法

     

    1. 3.4.1總述

        

    2. 以Sanger雙脫氧鏈終止法為代表的第一代測序方法應用較為廣泛，本條內容主要針對采用第一代測序技術的HLA基因分型檢測方法進行說明和要求。
14. 3.4.2常見問題可能原因及解決方法

     

    1. 3.4.2.1無序列峰圖信號

        

       1. a) 測序模板未能有效擴增，應對擴增產物進行電泳分析，確定是否有足量特異性擴增產物，如擴增產物存在問題，應重新擴增；

           

       2. b) 測序引物選擇存在問題，應核對加入引物的種類及加入量是否正確；

           

       3. c) 測序試劑配制、保存存在問題，每一步驟應嚴格按照標準操作規(guī)程進行。

           

    1. 3.4.2.2測序背景信號高

        

       1. a) 測序模板加入量沒有達到要求，應重新調整測序模板加入量；

           

       2. b) 測序模板純度（擴增條帶特異性差或 PCR抑制劑過多）沒有達到要求，應重新純化和擴增測序模板。

           

    1. 3.4.2.3雜峰信號過多

        

       1. PCR反應液污染，應重新進行擴增檢測；

           

       2. b) 測序模板加入量偏少，測序信號值偏低，應調整測序模板加入量；

           

       3. c) 測序引物特異性或延伸效率較差，應重新設計或合成測序引物；

           

       4. d) 存在堿基插入或缺失區(qū)段，應進行等位基因特異性擴增測序或克隆測序鑒定；

           

       5. e) GC含量過高，測序擴增反應效率過低，應調整測序 PCR程序或調整測序反應體系。

           

15. 3.5檢測方法的局限性

     

由于HLA具有高度多態(tài)性，在分型時測序區(qū)域有時會出現序列組合形式上有效相同的情況，這種情況既可能是由于兩個或多個等位基因在所檢測區(qū)域序列一致（兩者差異在所檢測區(qū)域之外），又可能是由于該測序區(qū)域存在相同的等位基因組合，此時應擴大檢測區(qū)域或采用等位基因選擇性擴增的方法進行

分型。

8質量控制

1. 1. 1原則和目的

       

   2. 檢測結果的正確性和高效性依賴于實驗室質量控制，質量控制包括對試劑、人員技能和設備儀器性能的質量控制。試劑包括檢測用的任何化學或生物制品，對試劑的正確標記、保存、配制和使用都非常重要，試劑使用不當可能會影響檢測結果的高效性甚至對檢測人員的健康和安全構成威脅。對人員的培訓、儀器的校準、維護維修也是質量控制的組成部分。實驗室開展的檢測項目應至少參加一項能力驗證/室間質量評價（Proficiency Testing/External Quality Assessment, PT/EQA）項目，如果沒有PT/EQA組織機構能夠提供對該項目的室間質量評價，實驗室應與其它實驗室建立平行檢測比較，至少每6個月一次。
2. 2人員檢測能力考核評估

    

3. 2.1實驗室主任、技術主管及檢測人員應參與實驗室檢測項目相關的繼續(xù)教育。

    

4. 2.2實驗室主任和技術主管應建立檢測人員技能評估的計劃和程序文件,至少每年對相關人員的技能進行一次評估并記錄。

    

5. 2.3實驗室主任和技術主管應對檢測人員的檢測能力進行考核并記錄。第一年至少考核兩次，一年后每年至少考核一次，每當檢測方法或者儀器發(fā)生變更時考核一次，離崗 6個月及以上人員再上崗前應增加考核一次。

    

6. 2.4實驗室主任和技術主管應每年至少一次向檢測人員發(fā)放相應的特定質控物作為盲樣，以驗證檢測人員對相應質控物的檢測能力。實驗室應保留每位檢測人員的驗證結果至少兩年。

    

   1. 2.5檢測能力考核評估記錄應包括以下內容：

       

      1. a) 常規(guī)檢測項目操作的規(guī)范性，包括樣本的準備、處理和檢測；

          

      2. b) 實驗記錄的完整性、真實性；

          

      3. c) 實驗結果的正確性；

          

      4. d) 儀器保養(yǎng)和操作的正確性；

          

      5. e) 質控記錄、PT/EQA結果、儀器維護記錄的完整性；

          

      6. f) 通過已檢測樣本、室內盲樣、室間質評樣本評估其檢測能力；

          

      7. g) 綜合評估其解決問題的能力。

          

7. 3試劑質量控制

    

8. 3.1試劑標記

    

9. 3.2供貨商評價

    

10. 3.2.1建立實驗室承認的供貨商評價系統(tǒng)，供貨商資格滿足實驗檢測要求。

     

11. 3.2.2建立合同審計制度。

     

12. 3.2.3建立供貨商所提供試劑的質量證明和質控報告記錄檔案。

     

13. 3.3試劑管理

     

14. 3.3.1建立實驗室常用試劑清單，包括但不限于以下內容：試劑名稱/化學式、毒性、制造商和貨號、制備要求、儲存要求。

     

15. 3.3.2建立實驗室試劑使用記錄/質控記錄，包括但不限于以下內容：試劑名稱、批號、接收日期、使用期限、配制日期或開啟日期、配制人或開啟人簽名。

     

16. 3.3.3所有過失效期的試劑應廢棄。

     

17. 3.3.4商業(yè)試劑盒不同批號間的試劑不應混用，除非制造商經實驗證明其對檢測結果無影響。

     

18. 3.3.5建立實驗室試劑庫存清單，以高效檢測期間試劑的供應，試劑庫存清單應包括但不限于以下內容：上一批訂購量、訂貨周期、最小庫存量。

     

19. 3.4試劑性能記錄

     

20. 3.4.1每種試劑在用于檢測前，都應滿足其最低標準要求。

     

21. 3.4.2每批新試劑用于檢測前，應檢測其性能指標，應與現用試劑具有同等質量、達到同樣性能標準。

     

22. 3.4.3當試劑性能指標超出可接受誤差范圍時，應重復實驗并上報實驗室技術主管。

     

    1. 3.5試劑質控的程序

        

    2. 應制定試劑質控程序，詳細說明質控過程，質控記錄應存檔。該記錄內容應包括試劑性能的可接受范圍和與歷史數據的比對。對于HLA基因分型，試劑質控主要針對引物和探針的特異性。
    1. 3.6試劑不能使用的原則

        

    2. 新批號試劑檢測結果與預期結果不符，不同批號試劑平行檢測中新批號試劑結果偏離較大，試劑造成質控品的檢測結果錯誤，試劑中發(fā)現有污染。
23. 3.7引物的質量控制（SSP方法）

     

24. DNA陽性質控品檢測 SSP引物陽性反應的特異性。若 SSP板第一孔是 DRB1*01特異的引物，則加入包含 DRB1*01的 DNA質控品；SSP板的每一孔都應加入相對應的陽性 DNA質控品。質控品可為已知分型的純合或雜合細胞株，也可使用已分型的患者或 PT/EQA樣本；陽性板的每個反應孔都應出現正確的特異性條帶，對于多基因型 SSP特異性引物，應用多個相對應的 DNA陽性質控品進行評價。

     

25. DNA質控品用于評估引物的陰性特異性。用兩個以上陰性 DNA質控品對 SSP板做檢測，陰性反應孔應只有內參條帶出現；陰性質控品應選擇與引物特異性非常接近的 DNA質控品，特別應針對容易出現假陽性的 SSP引物。

     

26. 3.7.3為整體評估 SSP全套引物的特異性，應對 DNA質控品做全套引物的完整分型，觀察、確認非特異性條帶和/或交叉反應出現。

     

27. 3.7.4應高效所用試劑質量滿足檢測要求。

     

28. 3.8探針的質量控制

     

29. 3.8.1SSO探針標記的質量控制

     

30. 3.8.1.1每條探針標記后，需用 DNA質控品進行檢測，高效其敏感性和特異性。

     

31. 3.8.1.2檢測結果應記錄在“探針質控工作表”中。

     

32. 3.8.1.3推薦每次進行 SSO分型時，同時包含 DNA質控品。

     

33. SSO質量控制

     

34. 3.8.2.1實驗室開發(fā)的反向 SSO，新批號的試劑應通過有效 DNA質控品的確認，以高效每條探針的特異性。

     

35. 3.8.2.2商業(yè)試劑盒用于患者樣本檢測前，應先用 DNA質控品進行評價。試劑使用過程中，應定期用 DNA質控品監(jiān)測探針的特異性。

     

36. 4設備的維護和校準

     

37. PCR儀、孵育箱、冰箱和水浴箱的溫度，用于監(jiān)控的溫度計使用前應進行校準。

     

38. 4.2PCR儀反應孔的溫度正確性和一致性應進行監(jiān)控，實驗室應規(guī)定孔間實際溫度偏差和預期溫度偏差的可接受范圍。

     

39. 4.3移液器應至少每年校準一次，移液器的使用和清潔應參照制造商的說明書。

     

40. 4.4測序儀等大型設備應制定日常維護的操作程序、日常維護檢查時間表，并記錄維護檢查結果，保存在維護手冊中。

     

41. 4.5應制定設備維護檢查結果的可接受范圍，當結果超出可接受范圍時采取糾正措施，包括但不限于以下：記錄故障發(fā)現過程、記錄儀器維修過程、將詳細故障告知相關人員、啟用備用程序和備用儀器。

     

42. 4.6設備故障維修后應通過實驗來驗證滿足檢測性能后，方可重新投入使用，并追溯評估故障前最后一次實驗結果的正確性。

     

43. 5PT/EQA項目

     

44. 5.1實驗室應參加由授權機構組織的 PT/EQA項目。

     

45. PT/EQA結果回報最后期限前，實驗室不應以任何形式與其他實驗室交流 PT/EQA樣本的檢測結果。如實驗室主任管轄范圍內多個分支實驗室同時參與 PT/EQA項目，應避免各實驗室檢測結果的交流。

     

46. 5.3實驗室不應將本實驗室的 PT/EQA樣本送至其他實驗室進行檢測，也不應將檢測結果傳至其他實驗室。

     

47. 5.4以對待常規(guī)臨床樣本的方式對待 PT/EQA樣本，所有檢測人員應參與 PT/EQA樣本的檢測。

     

48. 5.5實驗室應對 PT/EQA樣本的接收、保存、準備、處理、操作和檢測過程中的每一步驟及結果報告進行記錄并歸檔。與 PT/EQA有關的各項記錄的復印件至少在實驗室保存兩年，其中包括 PT/EQA樣本檢測結果回報表的復印件、所有與 PT/EQA組織單位就樣本檢測的交流記錄、實驗室主任或技術主管對每次的 PT/EQA樣本檢測或相關整改措施的審核報告的復印件。

     

49. PT/EQA不合格時，應調查和分析引起錯誤的原因，實施相應的整改措施并同時記錄歸檔。實驗室應緊急采取整改措施，確認同類錯誤未發(fā)生在臨床樣本檢測報告中。

     

50. 6DNA污染的控制

     

    1. 6.1原則和目的

        

    2. 聚合酶鏈反應(PCR)可以將DNA片段擴增到百萬倍甚至更多，但由于擴增產物可以在后續(xù)PCR循環(huán)里再次被擴增，因而使用PCR技術的一個風險就是擴增產物的實驗室污染。PCR實驗室的質量高效體系的一個重要部分就是監(jiān)控DNA污染。DNA污染可來自基因組DNA和擴增產物，均可導致假陽性的結果，從而造成實驗報告錯誤。因此，HLA基因分型實驗室應建立嚴格的標準，進行DNA污染的常規(guī)監(jiān)測。
51. 6.2實驗室布局和工作流程

     

檢測試劑應按5.3中的要求進行標記。

實驗室試劑配制、樣本制備、擴增及產物檢測應分別在3～4個相對獨立的區(qū)域內進行，可根據方法適當調整區(qū)域數量。應符合《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》的要求。

每個實驗室應建立單向工作流程，使用單向工作流程可減少污染的發(fā)生。

1. 1. 6.3實驗服和手套

       

   2. 根據實驗室情況，宜在試劑配制區(qū)、樣本準備區(qū)、擴增和檢測區(qū)分別配備專用實驗服，出入各區(qū)時更換。為減少潔凈區(qū)污染，每次進入試劑配制區(qū)時應配戴或更換新手套。
2. 6.4移液器

    

   1. 6.5試劑

       

   2. 所有用于核酸擴增的試劑應配制后分裝，并與樣本或擴增產物分開存放，以減少取樣次數，降低污染風險。應記錄試劑批號，一旦發(fā)生污染，可以追溯污染源。
   1. 6.6加樣

       

   2. 在開蓋前宜將反應管快速離心，小心開蓋以防氣溶膠形成。應在反應管中先加入非樣本反應組分（如dNTPs、引物、緩沖液、酶），再加入樣本，每加完一個樣本要蓋好蓋后再加下一個樣本。
3. 7對照反應

    

4. 7.1每次檢測應同時設置陽性對照和陰性對照。

    

5. 7.2陽性對照是包含已知的 DNA模板，其目的為證明擴增反應體系可正常工作。

    

6. 7.3陰性對照即為反應物空白對照，該對照包含正常反應除模板 DNA外的所有試劑，其目的是檢測有無模板 DNA的污染。

    

7. 8擴增產物的滅活方法

    

8. PCR擴增產物的滅活方法

    

9. 8.1.1酶滅活法：在擴增時用 dUTP代替 dTTP參與 PCR反應，生成 dU化的擴增產物，這種產物由于存在“非自然”狀態(tài)下的堿基而與靶 DNA相區(qū)別。細菌的尿嘧啶糖苷酶（UNG）加入反應混合物，上次擴增的 dU化的 PCR產物就會被 UNG降解，不會作為下一次擴增的模板。

    

10. 8.1.2局部滅活方案：可使用含氯漂白劑（例如次氯酸鈉）清潔工作臺面等，以清除殘留的 PCR產物或者其他污染源，用紫外燈照射工作臺面也是控制污染的有效措施。

     

    1. 8.2擴增產物滅活方法的實施

        

    2. 確定擴增產物滅活方法后應建立相應的驗證方法。酶滅活法應用稀釋的PCR產物人為“污染”反應液，然后分析滅活效果，以評價滅活方法的有效性。如果實驗室需要更換另一種滅活方法，應在更換前對新方法進行評價，并證實新方法的有效性。
    1. 9擦拭檢測監(jiān)控實驗室污染

        

    2. 開展HLA基因分型的實驗室應通過常規(guī)擦拭檢測（wipe test）、陰性對照、開管對照等途徑來監(jiān)測DNA污染或PCR擴增產物污染。擦拭檢測用于檢查實驗室設備和臺面是否被DNA或PCR擴增產物污染，對檢測結果陽性的區(qū)域需采取適當的整改措施。
11. 9.1擦拭檢測實施措施

     

12. 9.1.1用實驗室最常見擴增產物的擴增試劑常規(guī)監(jiān)測擴增前區(qū)域的污染情況。

     

13. 9.1.2監(jiān)測潛在的污染，使用的方法應達到常規(guī)檢測方法的靈敏度，且使用合適的引物。每次擴增至少包括一個陰性對照和一個陽性對照。

     

14. 9.1.3每次擦拭檢測宜包括污染監(jiān)測反應和陽性對照反應。

     

15. 9.1.4如果檢測到 PCR抑制的存在，應采取清潔措施排除 PCR抑制物的干擾，并重復檢測，確認抑制物被有效清除。

     

16. 9.1.5如果檢測到污染的存在，應采取清潔措施清除污染源，并重復檢測，確認污染源被有效清除。

     

17. 9.2污染監(jiān)測體系的建立

     

18. 9.2.1針對Ⅰ類和Ⅱ類基因擴增區(qū)域內的非多態(tài)區(qū)設計特異性引物，此引物能檢測到所有的 PCR產物和基因組 DNA污染。

     

19. 9.2.2建立并確認 PCR方法的擦拭檢測步驟。

     

20. DNA或稀釋的 PCR產物（作為摻入樣本對照），應確認擦拭檢測引物對所用分型方法產生的 PCR產物是有效的，反應液不含有干擾或抑制 Taq聚合酶活性的外來雜質。

     

21. 9.2.4根據瓊脂糖凝膠電泳有無 PCR產物，記錄“+”或“-”。

     

    1. 1總述

        

    2. 實驗室應提供及時、正確、清晰、高效和客觀的檢測報告，檢測報告應包括客戶的要求、檢測方法等內容。在為內部客戶或有書面協(xié)議的客戶檢測時可用簡化的報告方式。檢測報告可用紙版或電子版形式發(fā)布。實驗室應確保檢測報告的保密性。
    1. 2檢測報告的內容和格式

        

    2. 檢測報告應包含但不局限于以下內容：患者姓名、性別、出生日期、標本采集日期、標本號或病例號、樣本實驗室編碼和唯一標識、檢測方法的簡單描述、檢測結果及解釋、報告日期、報告單編號、實驗室負責人或其他授權人員的簽名、實驗室的名稱、地址和電話，檢測報告應標有頁碼和總頁數。報告內容可根據需求進行調整。
22. 2.1檢測報告的格式

     

23. 2.1.1檢測報告的格式應適用于各種檢測類型，減少產生誤解或誤用的可能性。應注意檢測報告的排版，使檢測數據的表達方式易于理解。檢測報告的表頭應標準化。

     

24. 2.1.2報告格式的設計應考慮所有可能出現的檢測結果，高效與相關指南或規(guī)定的要求相一致。檢測報告的格式應包括但不局限于以下因素：關鍵信息應突出顯示或重復描述、表達方式清晰（如提供范圍、閾值）、用于風險評估計算的信息、免責聲明或對檢測局限性的說明（如分析有效性、臨床有效性、非親子關系等）。

     

25. 2.2檢測報告的解釋

     

26. 2.2.1檢測報告中應給出檢測結果的解釋說明。

     

27. 2.2.2宜采用 IPD-IMGT/HLA數據庫解釋數據。

     

28. 2.2.3檢測結果的解釋應清晰、易于理解，便于非 HLA專業(yè)的醫(yī)生閱讀。

     

29. 2.2.4對檢測報告中未予解釋而客戶要求解釋的部分，應由臨床咨詢醫(yī)師或其他實驗室授權人員做出口頭或書面的解釋。

     

30. 3檢測報告的發(fā)放

     

31. 3.1檢測報告應經過實驗室主任或技術主管或其他授權人的審核和承認后發(fā)放。

     

32. 3.2實驗室提供的檢測報告可以是紙版或電子版形式，但只能將檢測報告發(fā)放給檢測申請者或其指定人員。

     

33. 3.3當用傳真的形式發(fā)放報告時應確保傳真件與Ö#21407;始紙版報告內容一致。傳真封面的收件人應為申請者或其指定人員。實驗室應采用封面提示注明傳真內容包含保密信息，受法律保護。

     

34. 3.4通過電話發(fā)放報告不能高效信息的隱私保護，應限制或禁止使用電話方式傳遞信息。

     

    1. 4檢測報告的修改

        

    2. 對已發(fā)放的檢測報告進行實質性修改，應僅采用追加文件或資料更換的形式，并包括如下說明：“對某某檢測報告的補充，報告單編號等”，或其他等效的文字形式。如要發(fā)布全新的檢測報告，應標注唯一性標識，并注明所替代的原件。
35. 5檢測報告的保存

     

36. 5.1每個實驗室應規(guī)定其檢測報告的保存時間、文件目錄和文件類型。

     

37. 5.2所有患者的檢測報告，應易于通過患者唯一性標識（如實驗室檢索號碼或病例號）檢索。

     

38. 5.3所有檢測報告均應妥善保管，并高效資料的保密性和完整性。

     

39. 5.4實驗室應保留檢測報告至少 5年，與家系有關的遺傳檢測的重要記錄通常至少應保存一代（20年）。

     

試劑配制區(qū)、樣本準備區(qū)、擴增和檢測區(qū)應分別配備專用移液器。應使用帶濾芯吸頭以防移液器管腔被氣溶膠污染。所有移液器應定期清洗。

9檢測報告10記錄管理

1. 1. 1總述

       

   2. 實驗室應建立收集、索引、存取、保存、維護和清理檢測記錄的程序。檢測記錄可有電子版和紙版等方式，其索引清晰，易于查詢，應存放在可防止損壞、變質、丟失的設施中。所有記錄應安全保護并采取保密措施，應規(guī)定記錄的保存期限。記錄應在授權后才允許公布。
2. 2電子記錄的管理

    

3. 2.1實驗室應有計算機系統(tǒng)，包含適用的軟件和硬件，用于記錄所有樣本的檢測信息。檢測信息包括檢測申請、檢測樣本的唯一標識、樣本來源、接收日期和時間、檢測數據、結果、檢測方法、檢測操作人員等。

    

4. 2.2實驗室的電子記錄應備份，但不能儲存在同一計算機或光盤上，實驗室應有訪問保護措施，防止未經授權的侵入或修改。

    

5. 2.3實驗室計算機系統(tǒng)只能限于授權人使用，以高效數據的完整性、安全性和高效性。

    

6. 2.4實驗室應有電子記錄備份的操作程序，在意外事件發(fā)生后可啟動電子數據恢復。

    

7. 2.5記錄中出現錯誤時，不可直接刪除，應在相應的位置寫出正確值，以避免原始數據的丟失或改動，對記錄的所有改動應備注改動人的簽名或簽名縮寫及日期。

    

8. 2.6實驗室電子記錄應保存 5年以上。

    

9. 3紙版記錄的管理

    

10. 3.1實驗室應按規(guī)定時限保存紙版記錄。

     

11. 3.2紙版記錄內容可包含檢測操作步驟、檢測樣本來源、唯一標識、檢測人員、檢測結果、檢測時間和實驗室主管簽字等。

     

12. 3.3記錄中出現錯誤時不可擦涂，應在相應的位置寫出正確值，以避免原始數據的丟失或改動，對記錄的所有改動應備注改動人的簽名或簽名縮寫及日期。

     

    1. 3.4紙版記錄應保存 5年以上。

        

    2. 11問題和糾正措施
13. 1實驗室應建立管理體系和程序文件，明確相應的責任，處理并記錄來自客戶和其他方面的投訴及問題，所有投訴均應進行調查并采取糾正措施。實驗室管理體系或技術操作中的問題，可以通過內部或外部的審核、管理評審、客戶的反饋等途徑進行解決。

     

    1. 2當檢測體系未能滿足實驗室規(guī)定的性能指標時，應記錄所有采取的糾正措施：

        

       1. a)儀器或方法處于操作參數或性能指標以外；

           

       2. b)檢測結果在實驗室檢測體系可報告結果范圍之外；

           

       3. c)實驗室確定的檢測程序的參考值（正常值）對檢測對象人群不適用；

           

       4. d)質控品和對照品的結果不符合實驗室的可接受標準；

           

       5. e)試劑、樣本的保存不符合規(guī)定。

           

14. 3糾正措施應便于獲得和執(zhí)行，以確保檢測結果和報告的正確可信。

     

15. 4應記錄、調查、糾正在患者樣本或 PT/EQA檢測中發(fā)現的任何問題，以防再次發(fā)生。

     

16. 5應記錄、調查、糾正任何由實驗室空間、人員安全條件不適所致的意外事件，以防再次發(fā)生。

     

17. 6糾正措施應從調查問題的根本原因開始，原因分析是糾正措施的關鍵，應仔細分析問題發(fā)生的所有潛在原因，包括但不限于：客戶要求、樣品類型、樣品規(guī)格、檢測方法和程序、人員的技能和培訓、耗材、設備及其校準等。

     

18. 7實驗室應對糾正措施的結果進行監(jiān)控，確認檢測體系能夠恢復到正常工作狀態(tài)，以確定所采取的糾正措施有效。

     

19. 8對實驗室檢測體系出現的任何問題，糾正措施被確認有效前，不應對臨床樣本進行檢測或發(fā)放報告，以避免錯誤的發(fā)生。

     

20. 9所有發(fā)現的問題、原因、解決方法、糾正措施和糾正后的結果均應記錄并存檔。

     

21. 10當檢測結果出現偏離或對實驗室的管理制度和程序產生懷疑時，實驗室應盡快對相應程序進行審核。審核常在糾正措施實施后進行，以確定糾正措施的有效性。

     

22. 11檢測體系出現錯誤的潛在原因和所需改進之處均應記錄，無論是技術方面還是管理體系方面，均應制定預防措施以減少類似錯誤的發(fā)生。

     

A

A

附錄 A （規(guī)范性） 擦拭檢測污染的監(jiān)測體系

A.1擦拭檢測的主要試劑和材料

a) 引物；

b) 擦拭檢測

PCR反應液；

c) 瓊脂糖凝膠；

d) 陽性對照：基因組 DNA或稀釋的 PCR產物。如使用 PCR產物，將預先擴增的 PCR產物梯度稀釋（1:1000到 1:1,000,000），檢測靈敏度須至少達到 1:10,000。選擇強陽性條帶的最高稀釋度作為擦拭檢測的陽性對照品；

e) 其他：濾紙或者棉簽、鑷子、純水、異丙醇。

A.2擦拭檢測步驟

A.2.1檢測點的確定

DNA提取純化區(qū)、PCR試劑配制區(qū)、潔凈區(qū)實驗臺、潔凈區(qū)地面及常用設備，均應進行擦拭檢測。

A.2.2擦拭步驟

a) 鑷子用異丙醇去污，并用超純水清洗，或者使用一次性無菌棉簽；

b) 用鑷子將直徑為

1.5cm的濾紙片在純水中浸濕，擦拭 10 cm ²的區(qū)域；

c) 將濾紙或棉簽放入 1.5mL離心管中，加 120 μL超純水，漩渦振蕩；

d) 56℃孵育

1 h，7000r/min離心 30s，4℃保存至使用。

A.2.3擦拭檢測 PCR步驟

a) 將擦拭檢測

PCR反應液加入 PCR管中，同樣將擦拭檢測 PCR反應液加入到在工作區(qū)開蓋至少一天的 PCR管中（作為空氣中氣溶膠污染的檢測，即開管陰性對照）；

b) 擴增反應包括陽性對照、陰性對照（無 DNA）、擦拭區(qū)待檢樣本、擦拭區(qū)摻入樣本的陽性對照、開管陰性對照；

c) 用實驗室標準擴增程序擴增擦拭樣本和對照；

d) PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并記錄結果；

e) 填寫實驗室污染檢測結果記錄表，見表 1。

A.3污染區(qū)處理

表 1實驗室污染檢測結果記錄表

應首先用1 mol/L HCl或者10%漂白劑清洗污染區(qū)，然后用潔凈水有效清洗干凈。在繼續(xù)進行常規(guī)檢測前，應重復進行擦拭檢測且結果為陰性（除了擴增后區(qū)域），污染區(qū)處理后的檢測結果應記錄在案（見表2）。

表 2污染區(qū)處理后的檢測結果記錄表

A.4結果判斷

a) 在陽性對照管中應有 PCR產物出現，陰性對照管中應無 PCR產物出現；

b) 每個擦拭檢測區(qū)域設置的“摻入樣本對照”均應出現 PCR產物，若該管無 PCR產物則提示 PCR反應可能被樣本中的某些物質所抑制，對應的“非摻入樣本管”的結果無效；

c) 若“非摻入樣本管”中有 PCR產物出現，說明存在基因組 DNA或 PCR產物的污染，應立即啟動去污染措施，并重復進行擦拭檢測以確認污染去除成功；

d) 每次檢測均應包括陽性對照，陽性對照可以是基因組 DNA或稀釋的 PCR產物，用以檢測引物是否有效；

e) 每次檢測均應包括陰性對照和/或開管陰性對照。陰性對照內不含已知來源的 DNA，用以檢測試劑污染和/或氣溶膠污染（開管陰性對照）。

參考文獻

[1] CLSI. Molecular Methods for Clinical Genetics and Oncology Testing; Approved Guideline. Third Edition. Wayne, PA: Clinical and laboratory standards institute, 2012

[2] Richards, C., Bale, S., Bellissimo, D. et al. ACMG recommendations for standards for interpretation and reporting of sequence variations: Revisions 2007. Genet Med, 2008, 10: 294 –300

[3] ASHI. Standards for Accredited Laboratories, Approved by CMS. American Society for Histocompatibility and Immunogenetics, 2019[4]《檢測和校準實驗室能力的通用要求》ISO/IEC 17025: 2017[5]《醫(yī)學實驗室質量和能力承認準則》ISO 15189: 2012, IDT[6]《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）[7]《中華人民共和國人類遺傳資源管理條例》（中華人民共和國國務院令〔2019〕第 717號）