2.1. 分離Energizer移植至受體BMSCs的特征

為了分離Energizer，我們使用了特殊配方的細(xì)胞裂解試劑盒，通過(guò)梯度離心從供體 BMSCs 中提取完整且具有生物活性的Energizer (圖1A  )。透射電子顯微鏡 (TEM) 分析證實(shí)了完整的Energizer的存在，其直徑約為 800 nm，呈現(xiàn)出獨(dú)特的球形結(jié)構(gòu) (圖 1B )。流體動(dòng)力學(xué)直徑測(cè)量表明Energizer的直徑為 983.8 ± 219.4 nm (圖 1C )。Energizer的 ζ 電位值為 -10.36 ± 1.02 mV。保持這種結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要，因?yàn)镋nergizer具有獨(dú)特的形態(tài)和內(nèi)部組織，有助于各種關(guān)鍵的細(xì)胞功能，如能量產(chǎn)生、代謝和凋亡調(diào)節(jié)。這些分析驗(yàn)證了提取的Energizer的高純度和結(jié)構(gòu)完整性。

隨后，將這些分離的Energizer移植到同一批號(hào)和同傳代數(shù)的受體 BMSC 中。采用 Mitoception 方法（圖 1B），將分離的Energizer移植到受體 BMSC 中可確保其整合和功能性攝取。為了驗(yàn)證受體 BMSC 內(nèi)是否存在移植的Energizer，我們?cè)诜蛛x之前用 MitoTracker 染料預(yù)先標(biāo)記了供體 BMSC Energizer。Energizer移植 24 小時(shí)后進(jìn)行的后續(xù)檢查顯示在對(duì)照細(xì)胞中沒(méi)有來(lái)自供體Energizer的可檢測(cè)到的熒光信號(hào)（圖 1F）。然而，在受體細(xì)胞內(nèi)可以觀察到清晰可辨的熒光信號(hào)（圖 1G）。為了觀察受體細(xì)胞對(duì)游離Energizer的攝取情況，我們?cè)贓nergizer移植后 5、10 和 15 分鐘使用了 TEM。我們的觀察證實(shí)了有游離Energizer進(jìn)入受體細(xì)胞（圖 1H）。這一觀察結(jié)果明確證實(shí)了Energizer成功且精確地移植到 BMSCs 中，從而證實(shí)了我們?cè)O(shè)計(jì)的Energizer移植方案的效率和功效。研究表明，Energizer移植的機(jī)制包括通過(guò)融合機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞、膜穿透、與細(xì)胞骨架的相互作用、細(xì)胞內(nèi)囊泡的形成以及自主運(yùn)動(dòng)。該過(guò)程利用與細(xì)胞膜的特定相互作用，同時(shí)保持Energizer的完整性和功能性。為了研究Energizer移植后內(nèi)源性Energizer和移植Energizer之間的關(guān)系，我們?cè)?BMSCs 中分別對(duì)兩種類型進(jìn)行了染色。我們的染色結(jié)果顯示，BMSCEnergizer內(nèi)源性Energizer和移植Energizer明顯共定位。

2.2. Energizer促進(jìn)BMSCs激活ECs并增強(qiáng)體外管腔形成

為了評(píng)估 BMSCs mito促進(jìn)內(nèi)皮管形成的能力，進(jìn)行了體外管形成試驗(yàn)（圖 2A） 。將 EC 與不同比例的 BMSCs 或 BMSCs mito （比例從 16:1 到 1:1）共培養(yǎng)，孵育 4 或 8 小時(shí)，同時(shí)在顯微鏡下觀察。隨著 BMSC 數(shù)量的增加，觀察到劑量依賴性趨勢(shì)，導(dǎo)致管數(shù)、連接點(diǎn)和管長(zhǎng)??度成比例增加。在體外管形成試驗(yàn)中，“管數(shù)”的增加表明血管生成增強(qiáng)，因?yàn)樗峁┝烁嗟墓艿纴?lái)輸送氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。“連接點(diǎn)數(shù)量”反映了血管網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和穩(wěn)定性，而“管長(zhǎng)度”的增加表明血管結(jié)構(gòu)延伸。這些變化共同意味著血管網(wǎng)絡(luò)形成更有效、更穩(wěn)定、更廣泛的作用。在 BMSC 比例為 4:1 和 8:1 時(shí)觀察到最佳的血管生成反應(yīng)。重要的是，在這些最佳比例下，BMSCsEnergizer與非 BMSCsEnergizer和 ECsEnergizer相比表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的血管生成潛力，這是在 4 小時(shí)和 8 小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的一致發(fā)現(xiàn)（圖 2B、C；圖 S1，支持信息）。

為了更真實(shí)地評(píng)估 BMSC mito對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成能力的影響，進(jìn)行了球體發(fā)芽試驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng) EC 與 BMSC mito以 4:1 和 8:1 的比例共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞發(fā)芽距離顯著增加且分支更密集（圖 2D、E）。通過(guò)體外球體發(fā)芽試驗(yàn)，遷移距離的增加表明細(xì)胞遠(yuǎn)離球體的移動(dòng)增強(qiáng)。這意味著細(xì)胞的遷移能力得到提高，這對(duì)于血管生成等過(guò)程至關(guān)重要。遷移距離越大意味著細(xì)胞越有效地伸入周?chē)h(huán)境，可能有助于新血管或組織結(jié)構(gòu)的形成。該參數(shù)對(duì)于評(píng)估測(cè)試條件在組織再生和修復(fù)背景下的促血管生成潛力至關(guān)重要。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)BMSC與EC的比例為4:1時(shí)，血管生成能力達(dá)到峰值。這種差異可能歸因于快速增殖，從而可能增強(qiáng)了較小BMSC群體的血管生成潛力。然而，增加BMSC的總量并沒(méi)有按比例增強(qiáng)血管生成，這間接表明觀察到的益處并非僅僅源于BMSC分裂加速。我們假設(shè)，較低的BMSC數(shù)量可能會(huì)限制Energizer增強(qiáng)帶來(lái)的有益作用，而較少的EC可能會(huì)降低血管生成潛力。

為了進(jìn)一步研究，我們使用裸鼠體內(nèi)皮下組織培養(yǎng)模型評(píng)估了 BMSCs mito在刺激 ECs 血管生成方面的血管生成潛力。對(duì)皮下組織的目視檢查顯示，與手術(shù)后第 2 天和第4 天的對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中新生的分支血管明顯增多（圖 3A）。組織學(xué)分析（包括 H&E 染色和 CD31 免疫細(xì)胞化學(xué)染色）顯示，實(shí)驗(yàn)組在第 2 天就開(kāi)始出現(xiàn)血管形成，與對(duì)照組和空白組觀察到的限制性效果形成鮮明對(duì)比。到第 4 天，所有組均出現(xiàn)血管形成，實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)得更好（圖 3B-E）。還證明了Energizer移植在傷口愈合、肌肉修復(fù)和缺血條件下刺激內(nèi)皮細(xì)胞血管生成方面的潛力。這些發(fā)現(xiàn)共同驗(yàn)證了Energizer移植在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增強(qiáng)內(nèi)皮管形成方面的強(qiáng)大作用。

2.3. BMSCs 促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞間的直接相互作用，增強(qiáng)血管生成

在我們研究Energizer移植如何增強(qiáng)促血管生成功能的潛在機(jī)制的過(guò)程中，我們探索了其在涉及 BMSCs mito和 ECs 的間接和直接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的影響。用綠色熒光標(biāo)記的 BMSCs mito和用紅色熒光標(biāo)記的 hUVECs 促進(jìn)了體外管形成和球體發(fā)芽。共聚焦顯微鏡顯示這些細(xì)胞類型之間緊密均勻的接觸（圖 4A、B），從而表明移植的Energizer在促進(jìn)更具凝聚力的分布和更大相互作用面積方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。生理上，MSCs 和 ECs 的接近被認(rèn)為可以促進(jìn)血管生成，[ 18 ] MSCs 和 ECs 在體內(nèi)參與復(fù)雜的相互作用。[ 5,19 ]因此，這些發(fā)現(xiàn)表明細(xì)胞通訊的基本模式是通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞之間的直接相互作用發(fā)生的。

相比之下，與對(duì)照組（僅含BMSC）相比 ，間接共培養(yǎng)的BMSCEnergizer在促進(jìn)血管生成方面沒(méi)有顯著差異（圖4C-H）。這表明細(xì)胞通訊可能不涉及可溶性因子分泌以外的機(jī)制。因此，我們采用了直接共培養(yǎng)模型，該模型證明了由細(xì)胞間直接相互作用驅(qū)動(dòng)的血管生成顯著增強(qiáng)。

2.4. Dll4‐Notch1信號(hào)對(duì)于BMSCsEnergizer促進(jìn)內(nèi)皮管形成至關(guān)重要

Notch 信號(hào)通路在細(xì)胞間直接相互作用中起著基礎(chǔ)性作用，尤其是在骨骼系統(tǒng)內(nèi)，從而對(duì)骨血管生成和成骨作用產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。[ 19 ]因此，我們旨在通過(guò)探索 BMSCs mito與 Notch 信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)來(lái)闡明其在促進(jìn)內(nèi)皮管形成中的關(guān)鍵作用。為了深入研究潛在的下游機(jī)制及其與 Notch 信號(hào)通路的潛在聯(lián)系，我們對(duì) BMSCs mito和 ECs 進(jìn)行了 24 小時(shí)的直接共培養(yǎng)，然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選以分離純的 BMSCs mito和 ECs 群。

與對(duì)照 BMSC 相比，將 BMSCs mito與 ECs 共培養(yǎng)，結(jié)果顯示 DLL4 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著增加（圖 5 A,C）。此外，將 ECs 與 BMSCs mito共培養(yǎng)可增強(qiáng) Notch1 受體及相應(yīng) Notch 信號(hào)通路中下游信號(hào)分子的激活（圖 5B,D）。

為了驗(yàn)證 DLL4‐Notch1 信號(hào)通路的作用，我們抑制了 hBMSCs [BMSCs mito (D4‐)] 中的 DLL4（圖 5E、F）。同時(shí)，我們?cè)?ECs [ECs (N1‐)] 中誘導(dǎo) Notch1 敲除（圖 G、H），并使用 Notch1 抑制劑橘皮素。體外管形成試驗(yàn)顯示，與 BMSCs mito ‐ECs 組相比，BMSCs mito (D4‐) ‐ECs組的血管生成功能降低（圖6 A-D）。此外，與 BMSCs mito共培養(yǎng)相比，將 EC 與 BMSCs mito (D4‐) 共培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致 Notch1 和下游信號(hào)基因的表達(dá)水平降低（圖 5I）。擴(kuò)展這些觀察結(jié)果，在病毒載體或抑制劑誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞（EC）Notch受體或信號(hào)通路抑制后，也觀察到了類似的血管生成功能降低（圖 6E-L ）。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了DLL4-Notch1信號(hào)通路在BMSCsEnergizer促血管生成作用中的關(guān)鍵作用。

2.5. BMSCs mito與 ECs 聯(lián)合移植后增強(qiáng)功能性血管網(wǎng)絡(luò)形成及對(duì)骨修復(fù)的治療效果

基于在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中觀察到的 BMSCs mito -ECs 促進(jìn)血管生成方面的積極成果，我們的研究隨后深入評(píng)估了三個(gè)不同的組：空白組、對(duì)照組（BMSCs-ECs）和治療組（BMSCs mito- ECs）。本研究主要關(guān)注點(diǎn)在于使用大鼠顱骨缺損模型，仔細(xì)觀察功能性血管網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育情況，并評(píng)估這些實(shí)驗(yàn)組中骨修復(fù)的進(jìn)展情況（圖 7 A）。

光學(xué)相干斷層掃描血管造影成像檢測(cè)到組織缺損內(nèi)的血流信號(hào)，勾勒出血管結(jié)構(gòu)的輪廓。術(shù)后 1 周和 2 周的 OCTA 結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的強(qiáng)血管形成密度明顯高于對(duì)照組和空白組（圖 7B  ）。此外，術(shù)后 2、4 和 8 周捕獲的微型 CT 圖像顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組和空白組相比，新生骨的積累更多（圖 7C）。骨礦物質(zhì)密度 (BMD) 分析表明實(shí)驗(yàn)組的 BMD 值明顯高于對(duì)照組（圖 7D、E）。組織學(xué)評(píng)估顯示實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)域內(nèi)有新生骨形成（圖 7E）。

這些共同的研究結(jié)果凸顯了Energizer移植在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）Energizer-內(nèi)皮細(xì)胞（mito -ECs）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的巨大潛力，這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠增強(qiáng)血管生成和骨再生。Energizer移植此前已在包括骨再生在內(nèi)的多種治療領(lǐng)域得到探索。然而，我們的研究推進(jìn)了這一領(lǐng)域，證明將健康Energizer移植到人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）中，并建立優(yōu)化的BMSCsEnergizer-內(nèi)皮細(xì)胞（ mito -ECs）共培養(yǎng)系統(tǒng)，可在體外和體內(nèi)模型中顯著增強(qiáng)其血管生成能力。

值得一提的是，天然 MSCs，尤其是那些位于組織內(nèi)的 MSCs，通常充當(dāng)血管周細(xì)胞。正如 Crisan 等人[ 20 ]所證明的，這些細(xì)胞積極支持和維持血管微環(huán)境內(nèi)的血管完整性。這與 BMSCsEnergizer在共培養(yǎng)時(shí)作為周細(xì)胞與 EC 重新結(jié)合的能力相一致。Schadler-Stewart 等人[ 21 ]闡明了 DLL4-Notch 信號(hào)在血管生成過(guò)程中周細(xì)胞形成中的作用，這為我們的觀察提供了機(jī)制上的見(jiàn)解。我們的研究發(fā)現(xiàn)，DLL4-Notch1 信號(hào)通路對(duì)于在 BMSCsEnergizer-EC 共培養(yǎng)中觀察到的增強(qiáng)的血管生成活性至關(guān)重要。這表明Energizer移植可以通過(guò)增強(qiáng) MSCs 的周細(xì)胞樣特性來(lái)增強(qiáng)其內(nèi)在的促血管生成功能。

在骨再生中，3D 基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞的空間排列和相互作用對(duì)于有效的組織形成和血管化至關(guān)重要。[ 22 ]例如，BMSC-EC 在 3D 環(huán)境中共培養(yǎng)，尤其是在細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 成分的支持下，已證明血管生成結(jié)果有顯著改善。[ 23 ]研究表明，在 ECM 成分的支持下，BMSC 和 EC 的 3D 聚集體可以創(chuàng)造一個(gè)更符合生理學(xué)的環(huán)境，以支持強(qiáng)勁的血管生成。[ 24 ]由于 ECM 支持的 3D 聚集體可以有效改善血管生成，因此這也可能與Energizer移植產(chǎn)生協(xié)同作用。這些 3D 配置還可以促進(jìn)細(xì)胞間基礎(chǔ)Energizer的轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)其整體再生潛力。

這項(xiàng)研究表明，接受Energizer移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的血管生成和骨再生，這可能為骨組織再生治療提供一種創(chuàng)新且可行的方法。然而，考慮到間充質(zhì)干細(xì)胞存在腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)，將BMSCsEnergizer移植用于治療仍有很長(zhǎng)的路要走。

細(xì)胞培養(yǎng)

兩種人類原代細(xì)胞培養(yǎng)物 hUVEC 和 hBSMC 均從 ScienCell Research Laboratories 購(gòu)買(mǎi)，并在市售間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基 (MSCM; 7501; ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA USA) 和內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基 (ECM; 1001; ScienCell Research Laboratories) 中培養(yǎng)。兩種原代Sprague-Dawley大鼠細(xì)胞培養(yǎng)物，rBMSCs和RAECs，購(gòu)自武漢普賽爾生命科技有限公司，培養(yǎng)于α-MEM（Hyclone SH30265.01）和高糖DMEM（Hyclone SH300222.01）培養(yǎng)基中，并添加10% (v/v) 胎牛血清（FBS）（Procell 164210-50）和1% (v/v) 青霉素-鏈霉素溶液（Procell PB180120）。細(xì)胞培養(yǎng)于37 °C、5% CO 2的濕化培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基每1至2天更換一次。實(shí)驗(yàn)中使用的所有細(xì)胞均在第4至7代之間。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有步驟均避免細(xì)胞和Energizer暴露于EDTA。對(duì)于Energizer移植，將供體和受體 BMSCs 以每孔 2 × 10 5 個(gè)細(xì)胞的密度接種到 6 孔板中，36 小時(shí)后收獲供體 BMSCs。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用培養(yǎng)細(xì)胞Energizer分離試劑盒（美國(guó)伊利諾伊州羅克福德市 ThermoFisher）從供體 BMSCs 中分離Energizer。進(jìn)行一系列差速離心步驟以分離Energizer和胞漿級(jí)分。將分離的Energizer直接懸浮在 1 mL 完全培養(yǎng)基中，并在移植前置于冰上。去除受體 BMSCs 的上清液，并將Energizer懸浮液緩慢添加到接近孔底的位置。對(duì)于對(duì)照 BMSCs，也去除上清液，并加入 1 mL 不含Energizer的培養(yǎng)基。將整個(gè)培養(yǎng)板在4°C下以1500 rcf離心15分鐘，然后放入37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)，并在相同條件下再次離心，以促進(jìn)細(xì)胞Energizer的攝取。之后將細(xì)胞放回37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

體外管形成試驗(yàn)

在無(wú)菌條件下，將24孔板每孔以250 µL Matrigel（美國(guó)新澤西州富蘭克林湖市Becton, Dickinson and Company公司）包被，包被過(guò)程中不得出現(xiàn)氣泡。然后將板在37 °C下孵育至少30分鐘，以使Matrigel完全凝固。接下來(lái)，將 hUVECs ： hBMSCs 的比例為 16:1（11.3 × 10 4 hUVECs 和 0.7× 10 4 hBMSCs），hUVECs ： hBMSCs 的比例為 8:1（10.7 × 10 4 hUVECs 和 1.3 × 10 4 hBMSCs），hUVECs ： hBMSCs 的比例為 4:1（9.6 × 10 4 hUVECs 和 2.4 × 10 4 hBMSCs），hUVECs ： hBMSCs 的比例為 1:1（6 × 10 4 hUVECs 和 6 × 10 4 hBMSCs），以及 hUVECs（12 × 10 4 hUVECs）接種在 Matrigel 上。最后加入300 μL培養(yǎng)基，將24孔板放入37 ℃、5% CO 2培養(yǎng)箱中孵育，分別于4和8 h后在相差顯微鏡下觀察管狀結(jié)構(gòu)的形成情況。

內(nèi)皮細(xì)胞球體的生成

使用濃度為 (2% w/v) 的瓊脂糖形成細(xì)胞球模具，同時(shí)防止細(xì)胞粘附在模具表面。將瓊脂糖加熱形成熔融溶液，然后加入 3D 培養(yǎng)皿 (Microtissues)。凝固后，將瓊脂糖模具置于六孔板中培養(yǎng)細(xì)胞。然后，在每個(gè)模具上接種 180 µL 細(xì)胞懸液，其中 hUVEC : hBMSC 的比例為 4:1（12 × 10 5 hUVEC 和 3 × 10 5 hBMSC），hUVEC : hBMSC 的比例為 8:1（13.3 × 10 5 hUVEC 和 1.7 × 10 5 hBMSC），hUVEC的接種量為15 × 10 5 hUVEC。二十分鐘后，加入培養(yǎng)基，讓細(xì)胞聚集體形成 24 小時(shí)。

基于球體的發(fā)芽血管生成試驗(yàn)

在體外發(fā)芽血管生成試驗(yàn)中，將球體過(guò)夜培養(yǎng)，然后將其包埋于I型膠原蛋白（美國(guó)康寧公司）中，并加入培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)皿置于37°C下孵育，使膠原蛋白凝膠化。之后，讓球體分別發(fā)芽12和24小時(shí)。之后，使用Image Pro Plus軟件測(cè)量每個(gè)球體中長(zhǎng)出的“噴”的長(zhǎng)度，并對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組8個(gè)球體進(jìn)行分析，從而對(duì)體外發(fā)芽進(jìn)行數(shù)字定量分析。

慢病毒的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)染

所有用于敲低 Notch1 和 DLL4 的與綠色熒光蛋白 (GFP) 融合的慢病毒載體均從上?；騽P生物技術(shù)有限公司 (中國(guó)上海) 購(gòu)買(mǎi)。

轉(zhuǎn)染scramble基因的細(xì)胞作為對(duì)照。慢病毒轉(zhuǎn)染前一天，將hBMSCs和hUVECs接種于6孔板中，密度為15 000個(gè)細(xì)胞/cm −2。接下來(lái)，將1 µL慢病毒顆粒（1.5 × 10 8 TU mL −1；上?；騽P化學(xué)有限公司，上海，中國(guó)）與5 µg mL −1聚凝胺（上?；騽P化學(xué)有限公司）和1 mL培養(yǎng)基加入細(xì)胞培養(yǎng)16小時(shí)。接下來(lái)，使用嘌呤霉素（P8833；Sigma-Aldrich）篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞3天。

蛋白質(zhì)印跡法

將培養(yǎng)的細(xì)胞用添加了蛋白酶抑制劑混合物（ThermoFisher，美國(guó)伊利諾伊州羅克福德）的 RIPA 裂解緩沖液（碧云天，中國(guó)上海）在冰上裂解。使用 BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（ThermoFisher，美國(guó)伊利諾伊州羅克福德）對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量分析。將六倍濃縮的 SDS 上樣緩沖液（P0015F；碧云天）加入蛋白質(zhì)中，然后在 100°C 下加熱 5 分鐘。然后，通過(guò) 10%（w/v）十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白質(zhì)提取物（30 µg），并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。用 5%（w/v）脫脂牛奶封閉膜，然后在 4°C 下與一抗孵育過(guò)夜，接著與偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的二抗孵育。使用eECL Western Blot試劑盒（江蘇科威生物科技股份有限公司）在膠片曝光機(jī)上進(jìn)行放射自顯影。一抗Notch1（A19090）和DLL4（A12943）購(gòu)自Abclonal公司?？?beta;‐肌動(dòng)蛋白（AF0003）的一抗和HRP標(biāo)記的IgG二抗（A0208、A0216）購(gòu)自碧云天公司。以β‐肌動(dòng)蛋白作為蛋白上樣對(duì)照。蛋白表達(dá)水平以β‐肌動(dòng)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析

使用 TRIzol 試劑（Invitrogen，美國(guó)）根據(jù)制造商說(shuō)明提取總 RNA。然后使用不同的引物進(jìn)行擴(kuò)增。使用生物光度計(jì)（Thermo Scientific NanoDrop8000）對(duì)獲得的 RNA 的質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行分光光度分析。然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara Bio Inc.，日本）將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ) DNA（cDNA）。使用 SYBR Green PCR 試劑盒（Roche，德國(guó)）在 ABI QuantStudio 3 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國(guó)加利福尼亞州福斯特城）上進(jìn)行定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (qPCR)。所有值均以 GAPDH 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物和外科手術(shù)

本研究使用 60 只 7 周齡雄性 Sprague-Dawley (SD) 大鼠。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn) (LA2017108 和 LA2019297)。為建立顱骨缺損模型，大鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射苯巴比妥鈉 (100 mg kg −1 ) 麻醉后，手術(shù)暴露背部顱骨。用鹽水冷卻的環(huán)鉆在頂骨每側(cè)造成兩個(gè)臨界大小的全層骨缺損 (直徑 5 mm)。分為 3 組 ( n =5)：空白組 — 雙側(cè)僅填充 Matrigel；對(duì)照組 — 雙側(cè)填充 Matrigel 和 4 × 10 5 rAEC 和 1 × 10 5對(duì)照 rBMSC；和治療——兩側(cè)均用 Matrigel 填充，每個(gè)缺損處填充 4 × 10 5 rAEC 和 1 × 10 5 rBMSCs mito 。

本研究使用18只8周齡雄性Balb/c裸鼠，裸鼠皮下注射細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為3組（n =6）：空白組：雙側(cè)注射Matrigel和10 × 10 6 hUVEC；對(duì)照組：雙側(cè)注射Matrigel和8 × 10 6 hUVEC及2 × 10 6 hBMSC；治療組：雙側(cè)注射Matrigel，同時(shí)每側(cè)注射8 × 10 6 hUVEC和2 × 10 6 hBMSC 。分別于2天和4天后收獲移植瘤。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：微型CT掃描評(píng)估

移植后1、2、4和8周，取顱骨樣本，在4% (w/v) 多聚甲醛溶液中4 °C固定36小時(shí)。隨后使用Viva40微型CT掃描儀（Scanco Medical. AG）檢查標(biāo)本。分析骨體積，并使用Scanco軟件基于處理后的圖像進(jìn)行三維重建。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：組織學(xué)分析

微型CT分析后，將大鼠顱骨脫鈣并石蠟包埋。對(duì)顱骨缺損中心部位5µm厚的組織切片進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析。然后，根據(jù)制造商的方案，對(duì)切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(H&E)和Masson三色染色。使用安裝在尼康Eclipse E800顯微鏡上的奧林巴斯D70相機(jī)拍攝圖像。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 (SEM) 表示。兩組以上數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析 (one-way unstacked ANOVA) 和事后 LSD 檢驗(yàn)。兩組配對(duì)樣本間的比較采用雙尾非配對(duì)學(xué)生 t檢驗(yàn)。p值小于 0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。