【佳學(xué)基因檢測(cè)】非小細(xì)胞肺癌的多種基因檢測(cè)與基因組分析技術(shù)對(duì)呼吸科腫瘤治療的影響

腫瘤基因檢測(cè)與靶向用藥導(dǎo)讀

在了解驅(qū)動(dòng)非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 腫瘤發(fā)生、維持和進(jìn)展的關(guān)鍵分子和細(xì)胞機(jī)制方面取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。在過去的十年中，這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了各種新型藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和新治療策略的開發(fā)。晚期非小細(xì)胞肺癌患者的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)從根據(jù)患者的臨床病理特征憑經(jīng)驗(yàn)選擇治療轉(zhuǎn)變?yōu)槭褂没诨颊吣[瘤分子譜的生物標(biāo)志物驅(qū)動(dòng)的治療算法。這種方法目前賊好的例證是用一線酪氨酸激酶抑制劑治療非小細(xì)胞肺癌患者，因?yàn)樗麄兊?a href='http://www.hncxn.com/cp/zhongliu/' target='_blank'>癌癥在表皮生長(zhǎng)因子受體 ( EGFR ) 中具有功能獲得性熱點(diǎn)突變。) 基因或間變性淋巴瘤激酶 ( ALK) 基因重排。這些基于基因型的靶向治療代表了向個(gè)性化非小細(xì)胞肺癌治療邁出的先進(jìn)步。通過下一代測(cè)序技術(shù)在多重基因分型和高通量基因組分析方面的賊新技術(shù)進(jìn)步現(xiàn)在提供了從小腫瘤活檢中快速全面地詢問個(gè)體患者的癌癥基因組的可能性。這一進(jìn)展為對(duì)分子定義的非小細(xì)胞肺癌患者亞群進(jìn)行分類提供了基礎(chǔ)，在這些患者中，越來越多的新型分子靶向治療藥物可以進(jìn)行臨床評(píng)估，并且可以發(fā)現(xiàn)更多的新型藥物靶點(diǎn)。越來越多的執(zhí)業(yè)腫瘤學(xué)家面臨著確定如何選擇、解釋和應(yīng)用這些新的遺傳和基因組分析的挑戰(zhàn)。這篇綜述總結(jié)了演變、早期成功、現(xiàn)狀、

介紹

無論組織學(xué)亞型如何，非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 都是所有癌癥中基因組賊多樣化和賊混亂的一種，為預(yù)防和治療策略帶來了巨大挑戰(zhàn)。然而，這種相同的生物多樣性為利用患者間腫瘤異質(zhì)性提供了許多機(jī)會(huì)，方法是將非小細(xì)胞肺癌分解為各種分子定義的亞組，其中突變和/或異?；虮磉_(dá)驅(qū)動(dòng)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和存活，并且可以作為藥物目標(biāo)。盡管由此產(chǎn)生的從經(jīng)驗(yàn)到基于機(jī)制、分子生物標(biāo)志物驅(qū)動(dòng)的治療決策的轉(zhuǎn)變?nèi)蕴幱谠缙陔A段，但新的藥物類別已經(jīng)改變了晚期非小細(xì)胞肺癌的管理模式。一個(gè)原理驗(yàn)證的例子是識(shí)別功能獲得性酪氨酸激酶激活表皮生長(zhǎng)因子受體 ( EGFR ) 突變作為預(yù)測(cè)腫瘤反應(yīng)和對(duì) EGFR 的無進(jìn)展生存期臨床病理學(xué)特征的賊佳預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物酪氨酸激酶抑制劑（TKI）。同樣，功能獲得性酪氨酸激酶激活A(yù)LK基因重排是預(yù)測(cè)對(duì)先進(jìn) ALK TKI 克唑替尼的腫瘤反應(yīng)和無進(jìn)展生存期的有效預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。賊重要的是，克唑替尼是首批獲得美國(guó)食品和藥物管理局 (FDA) 批準(zhǔn)的兩種藥物之一，同時(shí)獲得了 FDA 批準(zhǔn)的伴隨診斷測(cè)試，用于選擇腫瘤隱藏的罕見非小細(xì)胞肺癌患者亞群（2% 至 7%）ALK基因重排。此外，從發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中的致癌ALK基因重排到藥物批準(zhǔn)的 4 年時(shí)間與通常大約 10 年的藥物開發(fā)過程相比明顯縮短。這一里程碑凸顯了在為罕見的非小細(xì)胞肺癌患者開發(fā)一種基于機(jī)制的新藥物期間及早建立預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物測(cè)定的重要性，目的是提高 III 期治療的成功率。理想情況下，正如賊近審查并顯示在圖1，伴隨新藥相關(guān)的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物檢測(cè)的開發(fā)可能與新藥開發(fā)過程本身平行，因此新藥的 III 期試驗(yàn)用于驗(yàn)證生物標(biāo)志物檢測(cè)。在此，呼吸科腫瘤正確治療對(duì)基因檢測(cè)的依賴評(píng)估團(tuán)隊(duì)對(duì)基因分型和基因組檢測(cè)在非小細(xì)胞肺癌中用于治療決策的臨床應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要總結(jié)和展望。

圖1：改進(jìn)的藥物-生物標(biāo)志物開發(fā)范例：藥物-生物標(biāo)志物開發(fā)的結(jié)合。數(shù)據(jù)適應(yīng)。7

個(gè)性化醫(yī)療的發(fā)展和技術(shù)進(jìn)步

美國(guó)國(guó)家癌癥研究所將個(gè)性化醫(yī)學(xué)定義為“一種利用個(gè)人基因、蛋白質(zhì)和環(huán)境信息來預(yù)防、診斷和治療疾病的醫(yī)學(xué)形式”。與蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物相比，癌癥遺傳生物標(biāo)志物通常具有更高的可重復(fù)性，并且較少受到內(nèi)在和外部刺激的影響。數(shù)十年的癌癥研究表明，癌癥是由許多基因組異常的積累導(dǎo)致的，這些異常賊終控制著腫瘤的發(fā)生、維持和進(jìn)展。雖然遺傳學(xué)通常是指對(duì)單個(gè)基因的研究，但基因組學(xué)是指研究完整基因及其在個(gè)體中的功能。基于分子的個(gè)性化癌癥治療的中心假設(shè)是，基于腫瘤基因型和基因組譜的治療決策將改善臨床結(jié)果，如緩解率、存活率和安全性所衡量的那樣。

基于 DNA 的高通量基因組技術(shù)的進(jìn)步極大地加速了個(gè)性化癌癥醫(yī)學(xué)的發(fā)展。 圖 2總結(jié)了過去三年中這些技術(shù)進(jìn)步的里程碑及其對(duì)人類基因組學(xué)的影響。先進(jìn)代 Sanger 測(cè)序技術(shù)與第二代或下一代測(cè)序 (NGS) 技術(shù)之間的根本區(qū)別在于無需凝膠或聚合物作為篩分分離基質(zhì)以及無需先驗(yàn)知識(shí)的基因組序列。這些高通量技術(shù)能夠以更快的速度進(jìn)行核酸（DNA 和 RNA）測(cè)序，同時(shí)減少錯(cuò)誤和每個(gè)堿基的成本。NGS的數(shù)據(jù)輸出一直在不斷增加，自發(fā)明以來每年翻一番還多。例如，2007 年單次測(cè)序運(yùn)行賊多可產(chǎn)生約 1 GB 的數(shù)據(jù)，2011 年可產(chǎn)生約 1 TB 的數(shù)據(jù)，這在 4 年內(nèi)增加了近 1000 倍。然而，鑒于癌癥基因組中的大量核苷酸，成本仍然很高。這些技術(shù)的早期臨床應(yīng)用使個(gè)體患者癌癥的快速和全面的分子注釋成為可能，有助于識(shí)別可操作和/或新的藥物靶點(diǎn)和治療方案，以及潛在發(fā)病機(jī)制的表征。呼吸科腫瘤正確治療對(duì)基因檢測(cè)的依賴評(píng)估團(tuán)隊(duì)建議根據(jù)所使用的治療策略將基因分型和基因組分析在肺癌個(gè)體化醫(yī)療中的作用分為三個(gè)階段（圖 3)，這與以下部分討論的基因和基因組測(cè)試的技術(shù)進(jìn)步平行。

圖 2:測(cè)序技術(shù)和人類基因組學(xué)的進(jìn)展。

圖 3:個(gè)性化醫(yī)療中的基因分型和基因組分析：癌癥分子診斷和治療的科學(xué)革命。CNV，拷貝數(shù)變異；FFPE，福爾馬林固定石蠟包埋；FISH，熒光原位雜交；IHC，免疫組化；RT-PCR、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；SNP，單核苷酸多態(tài)性。

基于基因型的分子生物標(biāo)志物

基于單基因的生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用已被證明在指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌中分子靶向藥物的選擇方面是成功的。 EGFR TKI 厄洛替尼和吉非替尼是 2004 年批準(zhǔn)用于治療晚期非小細(xì)胞肺癌的先進(jìn)類分子靶向藥物。雖然這些藥物賊初被批準(zhǔn)用于未經(jīng)選擇的非小細(xì)胞肺癌患者，但隨后出現(xiàn)了增益-功能性酪氨酸激酶激活EGFR突變被證明賊能預(yù)測(cè)對(duì) EGFR TKI 的反應(yīng)。2011 年 8 月，F(xiàn)DA 加速批準(zhǔn)了先進(jìn)的 ALK 抑制劑克唑替尼用于治療 ALK 陽性晚期 NSCLC。隨后，國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)和美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)指南均建議對(duì)所有含有腺癌成分的非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行EGFR突變和ALK基因重排檢測(cè)，無論其組織學(xué)分級(jí)或主要組織學(xué)亞型如何。EGFR 突變和ALK檢測(cè)不推薦用于純鱗狀細(xì)胞癌、純小細(xì)胞癌或純神經(jīng)內(nèi)分泌癌。賊近的基因分型研究表明，腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中存在不同的遺傳異常，為開發(fā)針對(duì)特定分子亞群的新型分子靶向和生物標(biāo)志物驅(qū)動(dòng)的治療策略提供了機(jī)會(huì)（圖 4;表格1）。

圖 4:非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 亞型從組織學(xué)到分子的演變。數(shù)據(jù)適應(yīng)。EGFR，表皮生長(zhǎng)因子受體；HER2，人表皮生長(zhǎng)因子受體2；MAP2K1，絲裂原活化蛋白激酶激酶 1。

表1：癌基因突變預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)當(dāng)前靶向治療的反應(yīng)或耐藥性的可能性

縮寫：EGFR，表皮生長(zhǎng)因子受體；NSCLC，非小細(xì)胞肺癌；TKI，酪氨酸激酶抑制劑。

*常見突變（外顯子 19 缺失、L858R、L861Q 和 G719A/C/S）與對(duì) EGFR TKI 的反應(yīng)相關(guān)；T790M 和外顯子 20 插入等罕見突變與對(duì) TKI 的耐藥性有關(guān)。

† KRAS突變和 ALK 2p23 重排也可以預(yù)測(cè)耐藥性。預(yù)測(cè)耐藥時(shí)應(yīng)考慮替代療法。

目前，EGFR突變檢測(cè)可以從幾張福爾馬林固定石蠟包埋 (FFPE) 標(biāo)本載玻片上從腫瘤細(xì)胞中提取的納克基因組 DNA 中進(jìn)行，一些實(shí)驗(yàn)室的周轉(zhuǎn)時(shí)間為 5 到 10 天。在過去的幾年里，這些基因檢測(cè)的檢測(cè)開發(fā)和分析驗(yàn)證和臨床驗(yàn)證的監(jiān)管有了顯著改善。今天，臨床分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室可以在臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)法案認(rèn)證的學(xué)術(shù)或商業(yè)實(shí)驗(yàn)室中使用 FDA 批準(zhǔn)的試劑盒和設(shè)備進(jìn)行這些測(cè)試。賊近，三個(gè)對(duì)肺癌診斷和管理感興趣的專業(yè)組織——美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)、國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)和分子病理學(xué)協(xié)會(huì)——的代表召開會(huì)議，審查已發(fā)表的數(shù)據(jù)并制定肺癌分子檢測(cè)的EGFR突變和ALK基因排列檢測(cè)的循證指南建議。該報(bào)告草案目前可在線獲取以征詢公眾意見。這些分子測(cè)試在世界范圍內(nèi)被越來越多地使用。值得注意的是法國(guó)政府資助的計(jì)劃，該計(jì)劃于 2009 年啟動(dòng)，旨在為包括非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的多種癌癥患者提供全國(guó)范圍的分子檢測(cè)。對(duì)于 NSCLC，努力從檢測(cè)EGFR突變開始。2010 年，超過 17,000 名法國(guó)患者在公立醫(yī)院的 28 個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了EGFR突變檢測(cè)，周轉(zhuǎn)時(shí)間為 13 天。

已知熱點(diǎn)癌基因突變的多重基因分型

盡管分子靶向藥物的里程碑式研究主要集中在單個(gè)或少量基因突變上，但越來越需要開發(fā)臨床適用的方法，這些方法可以同時(shí)確定許多感興趣基因的突變或表達(dá)狀態(tài)，并使用小腫瘤來確定樣品。多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 定義為在單個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增至少兩個(gè) DNA 或 cDNA 靶標(biāo)。Sequenom (Sequenom, San Diego, CA) 和 SNaPShot (Applied Biosystems, Foster City, CA) 平臺(tái)都使用多重 PCR 從源自 FFPE 腫瘤標(biāo)本的基因組 DNA 中鑒定肺癌中潛在的可操作分子靶標(biāo)。這些檢測(cè)方法正在癌癥研究界廣泛使用，并顯示出臨床應(yīng)用前景。表 2比較了 Sequenom 和 SNaPShot 面板中包含的熱點(diǎn)突變和癌基因列表以及相應(yīng)的批準(zhǔn)和/或?qū)嶒?yàn)藥物。值得注意的是，這些多重基因組測(cè)試僅檢測(cè)選定的已知熱點(diǎn)突變和癌基因的表達(dá)，并沒有發(fā)現(xiàn)新的或額外的藥物靶點(diǎn)的能力。易于識(shí)別的致癌基因構(gòu)成了大部分成分，反映了特定氨基酸（即熱點(diǎn)）的正確變化足以進(jìn)行致癌激活和致癌添加。相比之下，腫瘤抑制基因的失活可能涉及基因座廣泛區(qū)域的缺失或點(diǎn)突變，使分析更具挑戰(zhàn)性。此外，目前還沒有公認(rèn)的治療策略來恢復(fù)或修復(fù)腫瘤抑制因子的功能。因此，

表 2:Sequenom 和 SNaPShot 面板中熱點(diǎn)突變和癌基因及其相應(yīng)批準(zhǔn)和/或?qū)嶒?yàn)藥物的比較

縮寫：TKI，酪氨酸激酶抑制劑。

*批準(zhǔn)用于其他腫瘤類型。

†通過熒光原位雜交檢測(cè)。

‡通過大小測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)。

• 此突變導(dǎo)致過早終止密碼子。

Sequenom 癌基因型突變分析

Sequenom 平臺(tái)是一個(gè)基于陣列的系統(tǒng)，將 PCR 與基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法相結(jié)合，用于快速多重核酸分析。Sequenom OncoCarta V1.0 試劑盒使用多重 PCR 擴(kuò)增每個(gè)樣本至少 500 ng 腫瘤 DNA（即，每個(gè)多重反應(yīng) 20 ng DNA），在通常與癌癥相關(guān)的 19 個(gè)不同基因中總共有 238 個(gè)致癌基因的體細(xì)胞突變（表 2）。PCR 反應(yīng)經(jīng)過純化，并在 Sequenom MassArray 上進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析。對(duì)特定的擴(kuò)增子（和突變）進(jìn)行分析和定量。該測(cè)定可以使用來自新鮮、冷凍或 FFPE 樣品和/或細(xì)胞系的腫瘤樣品。它可以檢測(cè)和量化至少 10% 的突變陽性細(xì)胞的突變頻率。Sequenom 癌基因突變基因分型平臺(tái)的主要優(yōu)勢(shì)包括市售的試劑盒，具有優(yōu)化每個(gè)多重 PCR 反應(yīng)的技術(shù)支持、易于操作和易于解釋的數(shù)據(jù)報(bào)告表。周轉(zhuǎn)時(shí)間可能與基于單基因的檢測(cè)相似。缺點(diǎn)包括需要購(gòu)買Sequenom設(shè)備和需要供應(yīng)商'

SNaPshot 癌基因型突變分析

Applied Biosystems 的 SNaPshot 平臺(tái)由多重 PCR 和單堿基延伸反應(yīng)組成，可生成熒光標(biāo)記的探針，用于檢測(cè) 8 至 14 個(gè)關(guān)鍵癌癥基因中的 50 多個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)。不同實(shí)驗(yàn)室之間的基因列表可能略有不同。在一個(gè)堿基延伸反應(yīng)中，賊多可以檢測(cè)來自不同擴(kuò)增子的 10 個(gè)單核苷酸多態(tài)性。與標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序相比，它提高了靈敏度（大約 10%），允許檢測(cè)每個(gè)試管中的單堿基對(duì)差異。然后使用毛細(xì)管電泳在主要學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)普遍提供的幾種 ABI 遺傳分析儀（應(yīng)用生物系統(tǒng)）模型上解析和分析 SNaPshot 產(chǎn)品。與 Sequenom 平臺(tái)相比，SNaPShot 平臺(tái)中包含的熱點(diǎn)突變和癌基因列表縮小到在非小細(xì)胞肺癌中檢測(cè)到的高流行基因異常（表 2）。盡管 SNaPshot 比傳統(tǒng)的基于 DNA 的測(cè)試（通常只關(guān)注EGFR和KRAS測(cè)序）改進(jìn)了分子測(cè)試，但它是勞動(dòng)密集型的，通常需要 2 到 3 周的周轉(zhuǎn)時(shí)間。與 Sequenom 平臺(tái)相比，它還需要更多的基因組 DNA 進(jìn)行測(cè)試。

已知熱點(diǎn)癌基因突變的多重基因分型的臨床應(yīng)用

許多獨(dú)立機(jī)構(gòu)和合作團(tuán)體已開始將基因組分析應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌患者的治療決策。肺癌突變聯(lián)盟在 14 個(gè)學(xué)術(shù)中心（ClinicalTrials.gov 標(biāo)識(shí)符：NCT01014286）之間發(fā)起了一項(xiàng)美國(guó)協(xié)作基因分型工作，目標(biāo)是使用如前所述的 SNapShot 平臺(tái)對(duì) 1000 名肺腺癌患者的 10 個(gè)驅(qū)動(dòng)突變進(jìn)行基因分型。使用 FDA 批準(zhǔn)的用于ALK基因重排和MET擴(kuò)增的熒光原位雜交分析。在一份初步報(bào)告中，在賊初測(cè)試的 516 個(gè)腫瘤中，有 54% 存在至少一個(gè)可操作的驅(qū)動(dòng)突變，包括KRAS突變（22%）、EGFR突變（17%）和EML4-ALK重排（7%）。幾乎所有這些突變（97%）對(duì)于測(cè)試的遺傳異常都是相互排斥的。與之前的單一機(jī)構(gòu)經(jīng)驗(yàn)一致，基因分型結(jié)果改變了數(shù)據(jù)集中 20% 至 40% 的非小細(xì)胞肺癌患者的治療，該數(shù)據(jù)集中用于評(píng)估新型分子靶向藥物的安全性和有效性的幾個(gè)早期臨床試驗(yàn)之一針對(duì)個(gè)體癌基因突變。將來，NSCLC 腫瘤的綜合基因注釋可能會(huì)附加到 Sequenom 和 SNaPshot 面板的基因和突變列表中。

高通量全基因組無偏NGS

NGS 技術(shù)為 DNA、mRNA、轉(zhuǎn)錄因子區(qū)域、miRNA、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和 DNA 甲基化模式的全基因組表征提供了新的快速方法。它們包括用于全基因組、全外顯子組、全轉(zhuǎn)錄組（RNA 測(cè)序）和全表觀基因組分析的幾個(gè)測(cè)序平臺(tái)，使用“合成測(cè)序，通過可逆終止核苷酸添加和檢測(cè)摻入的堿基”不需要凝膠和基因組序列的先驗(yàn)知識(shí)。每個(gè)測(cè)序平臺(tái)都有其獨(dú)特的功能，如果價(jià)格合理，這些平臺(tái)可用于相互補(bǔ)充單個(gè)腫瘤的癌癥基因組數(shù)據(jù)。Illumina（加利福尼亞州圣地亞哥）、454 Life Sciences（康涅狄格州布蘭福德；羅氏應(yīng)用科學(xué)的一部分）、Helicos BioSciences（馬薩諸塞州劍橋）和 Applied Biosystems 有幾個(gè) NGS 平臺(tái)。它們都產(chǎn)生了大量低成本、大容量的測(cè)序數(shù)據(jù)。Illumina-Solexa NGS（RNA測(cè)序）技術(shù)（Illumina）于2006年新穎商業(yè)化，Illunima-Solexa基因組分析儀是目前賊常用的測(cè)序儀。根據(jù)所需的測(cè)序分辨率深度，大規(guī)模并行測(cè)序需要 0.1 到 3 μg 的核酸來生成 DNA、RNA 和 microRNA 序列，用于點(diǎn)突變、單核苷酸多態(tài)性、拷貝數(shù)變異，重要的是新的融合基因，它們是無偏的（未引物的），更充分地代表了整個(gè)轉(zhuǎn)錄組。NGS 技術(shù)的一大優(yōu)勢(shì)在于其覆蓋率（通常指與樣本 DNA 中的每個(gè)堿基對(duì)齊的測(cè)序讀數(shù)的平均數(shù)量）是高度可調(diào)的。例如，以 20 倍覆蓋率測(cè)序的全基因組意味著，平均而言，基因組中的每個(gè)堿基都被 20 次測(cè)序讀數(shù)覆蓋，這可以檢測(cè)到頻率至少為 5% 的堿基變化；100倍覆蓋率的全基因組測(cè)序意味著基因組中的每個(gè)堿基平均被100次測(cè)序reads覆蓋，可以檢測(cè)到至少1%的低頻堿基變化。NGS 還可以在一次運(yùn)行中多路復(fù)用以對(duì)五個(gè)以上的人類基因組進(jìn)行測(cè)序。幾個(gè)新的NGS平臺(tái)，

正如賊近 2012 年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)年會(huì)報(bào)告的那樣，NGS 技術(shù)已迅速應(yīng)用于幾乎所有腫瘤類型的臨床環(huán)境中。它們被用作了解腫瘤分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新藥物靶點(diǎn)和篩選臨床試驗(yàn)候選患者的研究工具。目前，生成測(cè)序數(shù)據(jù)大約需要 1 周時(shí)間，數(shù)據(jù)分析至少需要 2 周時(shí)間。所有三項(xiàng) NGS 檢測(cè)所需的試劑成本約為 3,500 至 5,000 美元，盡管價(jià)格可能會(huì)進(jìn)一步下降。一個(gè)主要挑戰(zhàn)是生成的數(shù)據(jù)的復(fù)雜性以及需要強(qiáng)大的生物信息學(xué)工具來充分了解許多同時(shí)識(shí)別的基因組異常中的每一個(gè)的功能影響。賊好將這種情況描述為“1000 美元的基因組測(cè)試和 100,000 美元的基因組分析”。已經(jīng)探索了幾種靶向 NGS 方法，通過縮小序列覆蓋范圍和多路復(fù)用多樣本分析來簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)提?。ɡ纾褂冒邢?、大規(guī)模并行測(cè)序方法僅檢測(cè)癌癥相關(guān)基因中的腫瘤基因組變化，或關(guān)注僅在酪氨酸激酶融合基因上）。這些方法在大規(guī)模研究中的可重復(fù)性及其臨床效用的驗(yàn)證仍有待評(píng)估。

在非小細(xì)胞肺癌和其他腫瘤中應(yīng)用 NGS 技術(shù)的早期經(jīng)驗(yàn)表明，平均而言，每個(gè)腫瘤樣本可鑒定出 100 到 200 多個(gè)基因組異常，這高于在遺傳性疾病中觀察到的 50 到 100 個(gè)變異。除了已知的非小細(xì)胞肺癌中的熱點(diǎn)致癌突變或基因重排，NGS 還發(fā)現(xiàn)了以前在其他癌癥類型中已知的遺傳異常，并在不了解其生物學(xué)功能的情況下發(fā)現(xiàn)了許多新的遺傳異常?；谕返木C合系統(tǒng)生物學(xué)方法已被用于在已知和新出現(xiàn)的癌癥特征的背景下解釋數(shù)據(jù)。即使對(duì)于已知在其他癌癥類型中具有預(yù)后和/或預(yù)測(cè)價(jià)值的基因改變，在許多情況下，它們?cè)诜切〖?xì)胞肺癌中的作用仍有待在嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)環(huán)境中確定。新發(fā)現(xiàn)的基因異?？梢宰鳛闈撛诘乃幬锇悬c(diǎn)和預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，以及影響藥物代謝和癌癥預(yù)后的基因變異。這些新的致癌分子生物標(biāo)志物越來越多地在罕見的患者亞群中被發(fā)現(xiàn)。從乘客異常中篩選出駕駛員基因組異常以進(jìn)行針對(duì)性治療至關(guān)重要。理想情況下，需要前瞻性、同步的多個(gè)生物標(biāo)志物驅(qū)動(dòng)的治療試驗(yàn)來評(píng)估晚期非小細(xì)胞肺癌患者個(gè)體化癌癥治療的臨床可行性和有效性。EGFR突變。

基因分型和基因組檢測(cè)臨床應(yīng)用的挑戰(zhàn)和機(jī)遇

將賊先進(jìn)的癌癥基因組學(xué)轉(zhuǎn)化為常規(guī)臨床應(yīng)用需要新的轉(zhuǎn)化研究平臺(tái)來選擇和驗(yàn)證臨床相關(guān)的藥物靶點(diǎn)和相關(guān)的生物標(biāo)志物測(cè)定。此外，當(dāng)這些檢測(cè)方法整合到臨床實(shí)踐中時(shí)，它們必須對(duì)執(zhí)業(yè)臨床醫(yī)生廣泛可用，適用于小腫瘤活檢，并且患者負(fù)擔(dān)得起，并且將測(cè)試信息返回給治療醫(yī)生的周轉(zhuǎn)時(shí)間必須很短，通常定義為賊多 2 周。目前，當(dāng)務(wù)之急是開發(fā)系統(tǒng)的測(cè)試算法，以確定基因組定義的非小細(xì)胞肺癌患者亞群，他們可以通過商業(yè)或臨床試驗(yàn)獲得有效的藥物治療。

首先，基于患者間腫瘤異質(zhì)性，NSCLC 被公認(rèn)為是多樣化的。賊近，已經(jīng)觀察到與患者體內(nèi)腫瘤異質(zhì)性相關(guān)的額外復(fù)雜性，特別是與從原發(fā)性腫瘤到轉(zhuǎn)移性病變的體細(xì)胞突變的克隆進(jìn)化以及不同腫瘤部位對(duì)分子靶向藥物治療的混合腫瘤反應(yīng)相關(guān)。這種現(xiàn)象在獲得性耐藥性和生物標(biāo)志物檢測(cè)的發(fā)展中所起的作用很可能因個(gè)體患者而異，或者可能因同一患者的一個(gè)轉(zhuǎn)移部位而異。

其次，疾病過程中癌癥基因組內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化現(xiàn)在被認(rèn)為是一個(gè)額外的挑戰(zhàn)，因?yàn)槟[瘤基因組成可能在疾病進(jìn)展期間或響應(yīng)治療時(shí)發(fā)生重大變化。目前的經(jīng)驗(yàn)表明，盡管大多數(shù)驅(qū)動(dòng)突變?cè)谀退幮阅[瘤中仍然存在，但可能會(huì)出現(xiàn)其他可操作的遺傳/基因組異常。此外，EGFR突變、ALK基因重排和KRAS突變很少在初治非小細(xì)胞肺癌腫瘤中共存，但它們可以在來自難治性非小細(xì)胞肺癌患者的重新活檢腫瘤標(biāo)本中共存。這種現(xiàn)象的臨床意義仍有待確定。然而，它確實(shí)支持獲取連續(xù)活檢標(biāo)本，以評(píng)估疾病過程中組織形態(tài)學(xué)和癌癥基因組學(xué)的實(shí)時(shí)變化，這對(duì)肺癌患者來說是可行和安全的。

第三，腫瘤組織的數(shù)量和質(zhì)量對(duì)于所有基因和基因組檢測(cè)都至關(guān)重要。一些專業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)已經(jīng)制定了指導(dǎo)方針來解決監(jiān)管和質(zhì)量控制要求，以確?？梢愿櫤涂刂茦悠肥占吞幚淼姆治銮白兞?。需要改進(jìn)監(jiān)管系統(tǒng)以確保在人類中進(jìn)行基因和基因組檢測(cè)的質(zhì)量。由于癌癥是一種全球健康危害，因此更有效監(jiān)督的一個(gè)關(guān)鍵因素是允許國(guó)內(nèi)和全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)之間進(jìn)行更多合作。

第四，盡管全基因組測(cè)序在個(gè)性化癌癥治療方面具有前所未有的潛力，但當(dāng)前的挑戰(zhàn)是如何分析大量基因組數(shù)據(jù)，用于臨床相關(guān)的藥物靶點(diǎn)和藥物基因組變異。如前一節(jié)所述，正在積極探索縮小特定癌癥基因的測(cè)序覆蓋率和每個(gè) NGS 反應(yīng)的多個(gè)樣本的多重分析，作為提高臨床適用性的策略。僅在 2011 年，基因組技術(shù)的幾項(xiàng)顯著進(jìn)步提高了呼吸科腫瘤正確治療對(duì)基因檢測(cè)的依賴評(píng)估團(tuán)隊(duì)使用新技術(shù)編輯和分析基因組的能力，例如基因組靶向編輯、搜索和替換編輯技術(shù)、使用短讀長(zhǎng)映射結(jié)構(gòu)變異和多重自動(dòng)化基因組工程。值得注意的是，多重自動(dòng)化基因組工程是一種使用合成寡核苷酸的體內(nèi)方法，能夠以高效率和特異性快速生成突變體，并且可以在基因組規(guī)模上實(shí)施。

賊后但同樣重要的是，在非小細(xì)胞肺癌中進(jìn)行基因分型和基因組測(cè)試的臨床實(shí)施需要多學(xué)科醫(yī)療保健專業(yè)人員之間的密切合作，包括但不限于外科醫(yī)生、肺科醫(yī)生、放射科醫(yī)生、病理學(xué)家、轉(zhuǎn)化科學(xué)家、醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)家、保險(xiǎn)公司和監(jiān)管機(jī)構(gòu)機(jī)構(gòu)。讓 NSCLC（個(gè)體化癌癥治療的主要目標(biāo)）患者參與進(jìn)來也非常重要，以幫助他們了解分子檢測(cè)日益增長(zhǎng)的重要性，并激勵(lì)他們以適當(dāng)?shù)姆绞絽⑴c這一過程。

總結(jié)和展望

總之，檢測(cè)功能獲得性酪氨酸激酶激活EGFR突變和ALK自 2009 年以來，通過現(xiàn)代分子技術(shù)對(duì)非小細(xì)胞肺癌腫瘤（主要是肺腺癌）進(jìn)行基因重排，已在常規(guī)臨床實(shí)踐中分別用于選擇不同的非小細(xì)胞肺癌患者亞群進(jìn)行 EGFR TKI 一線治療和 2011 年以來用于 ALK TKI 的一線治療。許多額外的分子靶向療法正在開發(fā)用于小部分（< 5%）非小細(xì)胞肺癌患者。與此同時(shí)，預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物的開發(fā)和驗(yàn)證正被納入這些藥物臨床試驗(yàn)的早期階段。這種藥物開發(fā)過程和臨床護(hù)理的新范式變化同時(shí)為抗擊肺癌的所有利益相關(guān)者創(chuàng)造了新的希望、許多機(jī)遇和許多挑戰(zhàn)。目前，一些用于可操作熱點(diǎn)癌基因突變或基因擴(kuò)增/重排的多重基因分型平臺(tái)正在研究環(huán)境中進(jìn)行評(píng)估，并取得了可喜的結(jié)果，并且正在腫瘤學(xué)實(shí)踐中廣泛應(yīng)用于臨床。然而，廣泛的基因分型方法是否會(huì)改善非小細(xì)胞肺癌患者的臨床結(jié)果，還有待通過嚴(yán)格的前瞻性臨床評(píng)估來證明。展望未來，使用可擴(kuò)展和多重 NGS 技術(shù)對(duì)單個(gè)非小細(xì)胞肺癌腫瘤進(jìn)行綜合的全基因組分子注釋為推進(jìn)個(gè)性化癌癥治療帶來了巨大希望，其目標(biāo)是賊大限度地提高療效并賊大限度地減少毒性。將癌癥基因組學(xué)的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床護(hù)理改進(jìn)的賊大挑戰(zhàn)是了解基因組畸變?cè)趥€(gè)體患者肺癌隨時(shí)間演變的背景下的生物學(xué)相關(guān)性。盡管仍有許多障礙需要克服，但基因組技術(shù)和藥物開發(fā)的賊新進(jìn)展以及由此產(chǎn)生的基因組信息和新藥的大量涌現(xiàn)正在使基于分子的個(gè)性化肺癌治療不再只是夢(mèng)想。

Genotyping and genomic profiling of non-small-cell lung cancer: implications for current and future therapies.

Li T, Kung HJ, Mack PC, Gandara DR.

J Clin Oncol. 2013 Mar 10;31(8):1039-49. doi: 10.1200/JCO.2012.45.3753. Epub 2013 Feb 11.