【佳學(xué)基因檢測(cè)】人體細(xì)胞年輕態(tài)的基因檢測(cè)與評(píng)價(jià)方法

端?；驒z測(cè)導(dǎo)讀：

端粒縮短是生物衰老的一個(gè)眾所周知的生物標(biāo)志物。佳學(xué)基因?qū)y(cè)量端粒長(zhǎng)度的方法進(jìn)行的一項(xiàng)比較研究發(fā)現(xiàn)，使用不同的方法技術(shù)進(jìn)行研究結(jié)果的比較是困難的。賊常用的高通量測(cè)量平均端粒長(zhǎng)度的方法是定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）方法，有兩種可用的方案：相對(duì)端粒長(zhǎng)度（relative 端粒長(zhǎng)度）和先進(jìn)端粒長(zhǎng)度（先進(jìn)端粒長(zhǎng)度）方法。所有的qPCR方法都有相似之處，它們使用兩組不同的引物來測(cè)量端粒重復(fù)序列（TTAGGG）n和單拷貝基因區(qū)域，以計(jì)算平均端粒長(zhǎng)度（T/S比率）。相對(duì)端粒長(zhǎng)度和先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定的差異在于引入了雙鏈寡聚體標(biāo)準(zhǔn)來識(shí)別端粒長(zhǎng)度，而不是使用傳統(tǒng)的相對(duì)端粒長(zhǎng)度（T/S比率）方法。先前的研究注意到36B4（RPLP0）作為適合的單拷貝基因qPCR測(cè)定的問題。一項(xiàng)先前的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度出版物嘗試使用干擾素β 1基因（IFNB1）替代36B4（RPLP0）單拷貝基因，但與DNAm端粒長(zhǎng)度測(cè)定結(jié)果相比，結(jié)果顯示與端粒長(zhǎng)度結(jié)果的一致性不足。在這里，我們比較了先前用于先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定的兩種單拷貝基因測(cè)定方法，并提供了一種無非特異性引物擴(kuò)增的替代IFNB1單拷貝基因測(cè)定方法，以提供更一致的二倍體拷貝數(shù)確定和更高效、重復(fù)性強(qiáng)的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定方法。

端粒長(zhǎng)度基因檢測(cè)

端?？s短是佳學(xué)基因發(fā)現(xiàn)并推出的一個(gè)較為正確的人體及細(xì)胞衰老的生物標(biāo)志物。端粒長(zhǎng)度（端粒長(zhǎng)度）已經(jīng)被廣泛用于揭示細(xì)胞的衰老過程現(xiàn)象，以及與人類健康和疾病（如癌癥、心血管疾病、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等）相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素。測(cè)量端粒長(zhǎng)度可以使用多種方法進(jìn)行。其中一種方法是相對(duì)端粒長(zhǎng)度t方法的qPCR方法。佳學(xué)基因端粒長(zhǎng)度檢測(cè)的qPCR方法采用的是獲得諾貝爾獎(jiǎng)的酶學(xué)原理，在這一種方法中，采用基因解碼技術(shù)獲得的端粒序列指導(dǎo)設(shè)計(jì)項(xiàng)目檢測(cè)專用引物，通過擴(kuò)增端粒區(qū)域以確定端粒重復(fù)序列，并使用另一組引物擴(kuò)增單拷貝基因區(qū)域以確定在測(cè)試樣本中被測(cè)量的基因組拷貝數(shù)。先進(jìn)端粒長(zhǎng)度（先進(jìn)端粒長(zhǎng)度）方法與相對(duì)端粒長(zhǎng)度方法不同之處在于引入了兩個(gè)獨(dú)立的qPCR測(cè)定，使用雙鏈寡聚體構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別確定端粒重復(fù)序列或基因組拷貝數(shù)。通過引入序列稀釋的84mer雙鏈寡聚體標(biāo)準(zhǔn)，其中TTAGG重復(fù)14次，可以構(gòu)建端粒標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定端粒重復(fù)序列的平均數(shù)，單位為千堿基對(duì)（kbp）。通過引入另一個(gè)獨(dú)立的qPCR測(cè)定，使用單拷貝參考基因的雙鏈寡聚體標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測(cè)量每個(gè)二倍體基因組的總端粒長(zhǎng)度（以千堿基/染色體計(jì)）。

相對(duì)端粒長(zhǎng)度和先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定所使用的方法常用的方法是使用36B4基因作為單拷貝基因。賊初認(rèn)為36B4（RPLP0）基因測(cè)定是一個(gè)合適的單拷貝基因候選者，因?yàn)樵摲椒ㄔO(shè)計(jì)良好，遵循PCR技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，引物長(zhǎng)度為18-24個(gè)堿基對(duì)，擴(kuò)增目標(biāo)序列長(zhǎng)度在75-150個(gè)堿基對(duì)之間，G/C含量為40-60%，引物的起始或末端具有一到兩個(gè)G/C堿基對(duì)以增強(qiáng)引物的穩(wěn)定性。36B4（RPLP0）單拷貝基因位于染色體12q24.23區(qū)域（https://omim.org/entry/180510），該基因測(cè)定也設(shè)計(jì)得很好，引物序列中沒有互補(bǔ)或重復(fù)區(qū)域。佳學(xué)基因發(fā)現(xiàn)這一方法存在未被認(rèn)知的缺陷。佳學(xué)基因根據(jù)人類基因信息的精細(xì)解碼，發(fā)現(xiàn)在人類基因組中，36B4基因是具有多個(gè)偽基因的典型核糖體基因，而兩個(gè)引物均與染色體2和12上的基因組序列互補(bǔ)。此外，正向引物與染色體1、18以及反向引物與染色體5高度同源。

佳學(xué)基因新研究的方法使用了一種可行的用于相對(duì)端粒長(zhǎng)度測(cè)量的單拷貝基因替代方法，使用干擾素β 1基因（IFNB1）。這個(gè)位于染色體9p21.3區(qū)域的IFNB1基因編碼一種屬于干擾素家族的信號(hào)蛋白細(xì)胞因子，與COVID-19對(duì)先天免疫系統(tǒng)的自然衰老和端粒消耗有關(guān)。在新改進(jìn)的端粒長(zhǎng)度相對(duì)測(cè)定方法中，IFNB1引物是一個(gè)更好的單拷貝基因，因?yàn)樗鼈冎唤Y(jié)合到染色體9p21.3的一個(gè)位置，沒有已知的變異位點(diǎn)。端粒相對(duì)長(zhǎng)度的使用研究進(jìn)一步確認(rèn)了該方法的可行性與高效性，些相對(duì)端粒長(zhǎng)度研究已經(jīng)將這個(gè)IFNB1 端粒長(zhǎng)度測(cè)定方法納入到Telomeric DNA:RNA免疫沉淀（Telo-DRIP）qPCR方法并產(chǎn)生了好的結(jié)果，這些結(jié)查揭示出在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中端粒酶活性對(duì)端粒長(zhǎng)度的影響，以及顯示TERF1自身抗體與嚴(yán)重肺疾病中淋巴細(xì)胞端粒長(zhǎng)度短相關(guān)。

佳學(xué)基因?qū)Χ肆ｉL(zhǎng)度測(cè)量方法也進(jìn)一步優(yōu)化了端粒先進(jìn)長(zhǎng)度（先進(jìn)端粒長(zhǎng)度）的qPCR方法，在這一更新的方法中使用了IFNB1作為單拷貝基因。該方法使用一個(gè)83mer的IFNB1雙鏈寡聚體生成了單拷貝基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用IFNB1作為單拷貝基因的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法的比較研究未能得到與以DNA甲基化為基礎(chǔ)的端粒長(zhǎng)度估算器（DNAm端粒長(zhǎng)度）方法生成的端粒長(zhǎng)度結(jié)果一致。為了找出這種差異的可能原因，佳學(xué)基因解碼進(jìn)行了生物信息學(xué)和遺傳分析，以確定作為單拷貝基因的IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定的性能如何。佳學(xué)基因端?；驒z測(cè)將這些結(jié)果與使用36B4（RPLP0）作為單拷貝基因獲得的結(jié)果進(jìn)行比較，后者已被確定為不適合測(cè)量端粒長(zhǎng)度的單拷貝基因。通過基因解碼基因檢測(cè)技術(shù)，佳學(xué)基因發(fā)現(xiàn)了其他基因檢測(cè)方法中導(dǎo)致端粒長(zhǎng)度結(jié)果相關(guān)性缺失的可能原因，并提供了一種替代的基于IFNB1的單拷貝基因qPCR測(cè)定方法，用于使用先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法測(cè)量端粒長(zhǎng)度。

表1. 36B4（RPLP0）、比較IFNB1單拷貝基因和替代IFNB1單拷貝基因qPCR測(cè)定中使用的端粒重復(fù)序列和單拷貝基因的PCR引物和寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)。

Key: Forward primer = F; Reverse primer = R.

佳學(xué)基因檢測(cè)如何評(píng)估端粒長(zhǎng)度基因檢測(cè)的正確性？

佳學(xué)基因端粒長(zhǎng)度基因檢測(cè)正確性研究采用4名男性參與者（年齡范圍：8至50歲）和4名女性參與者（年齡范圍：15至52歲）。從同一成年參與者采集了全血和唾液，而從8歲和15歲的參與者只采集了唾液。另外還從一名額外的男性和女性參與者采集了全血和唾液，并與其他參與者一起進(jìn)行測(cè)試，以展示作為先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析的單拷貝基因的IFNB1替代方法的重復(fù)性。采集了全血，并按照制造商的方案使用Qiagen mini試劑盒進(jìn)行提取。使用Genotek Oragene試劑盒采集唾液，并按照制造商建議的方法進(jìn)行提取。使用ThermoFisher Scientific Quant-it dsDNA Assay試劑盒（目錄號(hào)：P11496）按照制造商的方案確定雙鏈DNA濃度。從全血和唾液提取的DNA樣本使用先前發(fā)表的36B4（RPLP0）和比較性IFNB1單拷貝基因測(cè)定方法的端粒重復(fù)序列和單拷貝基因qPCR協(xié)議進(jìn)行測(cè)試，使用的引物和寡聚體列在《佳學(xué)基因基因檢測(cè)序列使用數(shù)據(jù)庫(kù)》。使用引物和寡聚體的qPCR檢測(cè)方案。還重復(fù)測(cè)試了相同的DNA樣本兩次，并額外測(cè)試了4個(gè)使用IFNB1單拷貝基因測(cè)定方法的樣本。研究使用的所有引物和寡聚體均使用IDT（Integrated DNA technology）合成。所有引物均為HPLC純化，而寡聚體為PAGE純化。

表2. 比較IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定、替代IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定和36B4（RPLP0）先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定的qPCR運(yùn)行條件

Key: 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度 = absolute telomere length; IFNB1 = interferon beta 1; mins = minutes; secs = seconds.

使用先前發(fā)表的比較性IFNB1和36B4（RPLP0）單拷貝基因測(cè)定進(jìn)行端粒測(cè)量

表1顯示了用于端粒重復(fù)序列、比較性IFNB1和36B4（RPLP0）單拷貝基因qPCR測(cè)定的引物和寡聚體模板對(duì)照。佳學(xué)基因比較不同端粒的qPCR測(cè)定中用于確定端粒重復(fù)序列和每個(gè)單拷貝基因的qPCR檢測(cè)方案列在表2中。由于先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法在單個(gè)qPCR擴(kuò)增方法中使用SYBR Green（而不是多重?cái)U(kuò)增），因此幾乎沒有信號(hào)泄漏導(dǎo)致端粒qPCR測(cè)定的端粒重復(fù)序列數(shù)量或單拷貝基因qPCR測(cè)定的二倍體拷貝數(shù)出現(xiàn)問題的擔(dān)憂。

端粒重復(fù)序列標(biāo)準(zhǔn)曲線使用60 pg（6 × 10^-11 g）的端粒雙鏈寡聚體濃度進(jìn)行十倍稀釋。比較性IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線使用2 pg（2 × 10^-12 g）的比較性IFNB1雙鏈寡聚體濃度進(jìn)行十倍稀釋，生成的稀釋液范圍從標(biāo)準(zhǔn)1的0.2 pg到標(biāo)準(zhǔn)5的0.00002 pg（使用4 uL寡聚體）。由于在比較性IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定中發(fā)現(xiàn)潛在問題，佳學(xué)基因還通過向每個(gè)比較性IFNB1寡聚體濃度中添加質(zhì)粒DNA（pBR322）并執(zhí)行兩步qPCR方案來測(cè)試該測(cè)定，如表2所列。

佳學(xué)基因還使用使用200 pg（200 × 10^-12 g）的36B4（RPLP0）雙鏈寡聚體濃度進(jìn)行十倍稀釋，生成的稀釋液范圍從標(biāo)準(zhǔn)1的200 pg到標(biāo)準(zhǔn)5的0.2 pg。為了保持每個(gè)反應(yīng)管中的總DNA量為3 ng，我們向每個(gè)36B4（RPLP0）寡聚體稀釋液中添加了質(zhì)粒DNA（pBR322）（表2）。

使用替代IFNB1單拷貝基因qPCR測(cè)定的端粒長(zhǎng)度

為了評(píng)估采用IFNB1單基因?qū)Χ肆６葴y(cè)定結(jié)果的影響，佳學(xué)基因生成了替代IFNB1單拷貝基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用表1中列出的引物和寡聚體中的82mer雙鏈寡聚體。替代IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線是在表2中列出的qPCR檢測(cè)得到的。使用2 pg（2 × 10^-12 g）的替代IFNB1寡聚體濃度進(jìn)行十倍稀釋，生成的稀釋液范圍從標(biāo)準(zhǔn)1的0.2 pg到標(biāo)準(zhǔn)5的0.00002 pg。在PCR擴(kuò)增過程中，向每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)寡聚體稀釋液中添加環(huán)形質(zhì)粒DNA（pBR322，Thermo Fisher Scientific），以保持每個(gè)反應(yīng)管中的總DNA量為3 ng（表2）。替代IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用包含1倍QuantiTect SYBR Green Master Mix（Qiagen）、0.01U尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG：Thermo Fisher Scientific）、0.1μM正向引物、0.1μM反向引物的混合溶液在20μL反應(yīng)中生成的。生成的IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算測(cè)試樣本中的二倍體基因組數(shù)量，該過程與用于端粒重復(fù)序列標(biāo)準(zhǔn)曲線qPCR混合液和qPCR條件的類似方案進(jìn)行了確定。

PCR擴(kuò)增是使用QIAgility機(jī)器人工作站（Qiagen，德國(guó)）進(jìn)行的。實(shí)時(shí)定量PCR在50°C保持2分鐘激活UNG，然后在95°C保持15分鐘激活Qiagen Hotstar Taq DNA聚合酶，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)在95°C保持15秒，60°C保持1分鐘（表2），數(shù)據(jù)采集使用Rotor-Gene Q 5plex HRM（Qiagen，德國(guó)）進(jìn)行。在qPCR擴(kuò)增完成后，通過從50°C到99°C每次升高1°C的方式產(chǎn)生解離曲線。Rotor-Gene Q qPCR儀器還會(huì)自動(dòng)確定每個(gè)板的端粒和IFNB1寡聚體標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct閾值。每個(gè)3 ng的DNA或寡聚體樣品都進(jìn)行了三次重復(fù)測(cè)量，并取平均值。為了減輕批次效應(yīng)，在每次運(yùn)行中包含至少10次來自參考對(duì)照的重復(fù)測(cè)量。從短端粒陽(yáng)性對(duì)照（Jurkat細(xì)胞系；訪問編號(hào)SD1111，Thermo Fisher Scientific）中提取的參考DNA進(jìn)行分裝并冷凍保存。對(duì)于每個(gè)樣品，通過將樣品中的二倍體基因組數(shù)除以從端粒標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的端粒重復(fù)數(shù)來計(jì)算每個(gè)樣品的總端粒長(zhǎng)度。由于每個(gè)二倍體基因組末端有兩個(gè)端粒，因此該端粒長(zhǎng)度數(shù)值然后除以92，以確定樣品中一個(gè)端粒的平均長(zhǎng)度。

端粒長(zhǎng)度測(cè)量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用R Studio進(jìn)行分析。佳學(xué)基因使用了組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（ICC）統(tǒng)計(jì)量來分析作為測(cè)量平均端粒長(zhǎng)度的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法的可行替代性qPCR測(cè)定的替代IFNB1單拷貝基因的重復(fù)性。ICC是根據(jù)研究中使用的重復(fù)樣本批次中全血白細(xì)胞和唾液測(cè)定的端粒長(zhǎng)度計(jì)算得出的。

不同端粒長(zhǎng)度測(cè)量方法的比較結(jié)果

通過進(jìn)行生物信息學(xué)和遺傳分析，發(fā)現(xiàn)了比較性IFNB1單拷貝基因測(cè)定需要進(jìn)一步改進(jìn)的問題。由于在修改IFNB1 的qPCR測(cè)定時(shí)這些問題尚未解決，佳學(xué)基因?qū)⒃摐y(cè)定與另一種替代性IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定進(jìn)行了比較，并將所有IFNB1單拷貝基因qPCR測(cè)定的生物信息學(xué)和遺傳分析與36B4（RPLP0）單拷貝基因qPCR測(cè)定進(jìn)行了比較。

比較性IFNB1單拷貝基因先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定
 

生物信息學(xué)分析

在比較性IFNB1單拷貝基因先進(jìn)端粒長(zhǎng)度研究針對(duì)的是IFNB1基因區(qū)域的3'端。表1中列出的比較性IFNB1標(biāo)準(zhǔn)寡聚體序列顯示，使用83堿基對(duì)的雙鏈寡聚體模板與引物結(jié)合，生成已知二倍體拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這個(gè)雙鏈寡聚體的長(zhǎng)度略長(zhǎng)于36B4（RPLP0）先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定中使用的75堿基對(duì)的雙鏈寡聚體，但仍處于建議的75-150 bp擴(kuò)增靶序列范圍內(nèi)，以獲得賊佳PCR實(shí)驗(yàn)效果。

比較性IFNB1雙鏈寡聚體序列（表1中列出）在USCS基因組Blast搜索中顯示，這個(gè)83堿基對(duì)的模板僅位于IFNB1基因的9p21.3染色體位置，并且與IFNB1基因中的3'外顯子-內(nèi)含子連接相鄰。比較性IFNB1引物的Primer-BLAST搜索顯示，表1中列出的25堿基對(duì)IFNB1正向引物和26堿基對(duì)IFNB1反向引物結(jié)合到3'外顯子-內(nèi)含子的IFNB1位置。這些比較性IFNB1引物的長(zhǎng)度略長(zhǎng)于36B4（RPLP0）引物，原始先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定中使用的長(zhǎng)度為23 bp的正向引物和25 bp的反向引物，并且略長(zhǎng)于PCR賊佳實(shí)踐中建議的18-24 bp。

此外，比較性IFNB1正向引物的熔解溫度（Tm）為78°C（G/C = 14 × 4；A/T = 11 × 2），而比較性IFNB1反向引物的熔解溫度（Tm）為78°C（G/C = 13 × 4；A/T = 13 × 2）。盡管兩個(gè)引物的熔解溫度相差不超過5°C，但比較性IFNB1引物違反了良好PCR設(shè)計(jì)的原則，因?yàn)樗鼈兊娜劢鉁囟龋═m）未在50°C至60°C之間。

圖1. IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度基因檢測(cè)方案的的生物信息學(xué)分析 a）比較性IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度雙鏈寡聚體標(biāo)準(zhǔn)，b）與比較性IFNB1反義寡聚體形成發(fā)夾環(huán)，c）替代IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度雙鏈寡聚體標(biāo)準(zhǔn)。

此外，比較性IFNB1反義寡聚體序列中的GTGT二核苷酸重復(fù)區(qū)域允許形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)（圖1b）。寡聚體發(fā)夾環(huán)的形成可能會(huì)降低比較性IFNB1反義寡聚體的擴(kuò)增效率，導(dǎo)致使用比較性IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算基因組拷貝數(shù)時(shí)出現(xiàn)不正確的情況。當(dāng)在任何端粒長(zhǎng)度測(cè)定中使用比較性IFNB1單拷貝基因測(cè)定時(shí)，這將導(dǎo)致對(duì)任何測(cè)試樣本的二倍體拷貝數(shù)計(jì)算的不正確性。

基因信息分析

進(jìn)一步進(jìn)行了遺傳學(xué)分析以驗(yàn)證對(duì)比性IFNB1單拷貝基因先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法的生物信息學(xué)評(píng)估正確性，使用表2中列出的IFNB1 qPCR條件進(jìn)行了遺傳學(xué)分析。表2還列出了使用同一DNA樣本等體積進(jìn)行測(cè)定端粒重復(fù)序列數(shù)的qPCR條件。佳學(xué)基因?qū)⑦@些結(jié)果與使用36B4（RPLP0）qPCR測(cè)定得到的結(jié)果進(jìn)行了比較。值得注意的是，一些機(jī)構(gòu)IFNB1 qPCR測(cè)定未列出環(huán)形質(zhì)粒DNA（pBR322）的添加，而36B4（RPLP0）先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定中添加了環(huán)形質(zhì)粒DNA（pBR322）以保持每個(gè)端粒和36B4（RPLP0）寡聚體濃度下反應(yīng)體系中總DNA的恒定量，用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案的過程中， 佳學(xué)基因按照表2中列出的無質(zhì)粒的比較性IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行分析。值得注意的是，一些機(jī)構(gòu)采用比較性IFNB1 qPCR的條件采用了三步法的qPCR循環(huán)條件，包括50 °C 2分鐘，95 °C 15分鐘的啟動(dòng)步驟，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95 °C 15秒，60 °C 1分鐘，以及一個(gè)72 °C 30秒的延伸步驟（表2），同時(shí)適用于端粒重復(fù)序列和比較性IFNB1單拷貝基因的qPCR。從這些條件與原始的36B4（RPLP0）先進(jìn)端粒長(zhǎng)度 qPCR運(yùn)行條件（95 °C 10分鐘，然后40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95 °C 15秒，60 °C 1分鐘，隨后進(jìn)行熔解曲線）的比較中可以看出這是一個(gè)變化。因此，佳學(xué)基因端粒基因檢測(cè)在分析中使用了兩步法的qPCR擴(kuò)增方案，36B4（RPLP0）測(cè)定采用60 °C退火溫度，比較性IFNB1 qPCR（無質(zhì)粒）實(shí)驗(yàn)方案采用了三步法的qPCR擴(kuò)增方案，包括60 °C退火和72 °C延伸步驟（表2）。為了觀察到賊稀釋的比較性IFNB1標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增情況，還將比較性IFNB1單拷貝基因測(cè)定的PCR循環(huán)次數(shù)從40次延長(zhǎng)到了45次。

36B4（RPLP0）和比較性IFNB1單拷貝基因qPCR測(cè)定的結(jié)果如表3、表4和表5所示。通常情況下，標(biāo)準(zhǔn)曲線的10倍稀釋應(yīng)該得到ΔCt值在-3.60到-3.10個(gè)循環(huán)之間，反映每個(gè)qPCR循環(huán)中寡核苷酸模板翻倍2倍，PCR效率在90%到110%之間。表5中呈現(xiàn)的結(jié)果表明，對(duì)于36B4（RPLP0）寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度，這種情況確實(shí)存在，得到了中位數(shù)（±標(biāo)準(zhǔn)偏差）的ΔCt值為-3.20（±0.05），PCR效率為1.05（或105%），R2為0.99990。相反，表3表明，無論是使用帶質(zhì)粒的比較性IFNB1 qPCR擴(kuò)增方案還是不帶質(zhì)粒的比較性IFNB1 qPCR擴(kuò)增方案，當(dāng)10倍稀釋比較性IFNB1寡核苷酸時(shí)，沒有反映出寡核苷酸的兩倍增加，對(duì)于不帶質(zhì)粒的三步法比較性IFNB1 qPCR測(cè)定，得到了中位數(shù)（±標(biāo)準(zhǔn)偏差）的ΔCt值為-1.91（±1.53）。不帶質(zhì)粒的比較性IFNB1 qPCR測(cè)定的PCR效率為2.33（或233%），R2為0.868（表3）。這些結(jié)果與部分基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)的比較研究中的結(jié)果相似（分別為1.987和0.999319；表3）。這個(gè)結(jié)果可能是由于寡核苷酸發(fā)夾環(huán)隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的，從而減少了可用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的寡核苷酸。增加PCR退火溫度或在分析中使用更高濃度的寡核苷酸或DNA可能會(huì)改善比較性IFNB1單拷貝基因測(cè)定。有趣的是，這種使用10倍稀釋的比較性IFNB1寡核苷酸的循環(huán)數(shù)差異與不帶質(zhì)粒的比較端粒（三步法）qPCR測(cè)定中并不相關(guān)，得到了中位數(shù)（±標(biāo)準(zhǔn)偏差）的ΔCt值為-3.36（±0.61），PCR效率為0.99，R2為0.99（表3），而與Hastings等人（2022年）的研究中列出的PCR效率為2.0465，R2為0.999102的結(jié)果相比。使用質(zhì)粒的端粒（兩步法）qPCR測(cè)定也得到了類似的結(jié)果（表4）。

表3. 使用不含質(zhì)粒的比較IFNB1（三步）qPCR方案計(jì)算端粒長(zhǎng)度

佳學(xué)基因還在每個(gè)比較性IFNB1寡核苷酸稀釋液中添加了3 ng的圓形質(zhì)粒DNA（pBR322），然后再次運(yùn)行了兩步法qPCR實(shí)驗(yàn)方案的比較性IFNB1 qPCR測(cè)定。將改變后的比較性IFNB1 qPCR測(cè)定方法的結(jié)果呈現(xiàn)在表4中。在為每個(gè)比較性IFNB1寡核苷酸稀釋液添加質(zhì)粒DNA，并執(zhí)行兩步法qPCR實(shí)驗(yàn)方案后，與不帶質(zhì)粒的三步法相比，得到了類似的結(jié)果，中位數(shù)ΔCt（±標(biāo)準(zhǔn)偏差）為-1.83（±1.53），反映了PCR效率為2.53和R2為0.89（表4）。端粒重復(fù)序列qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線給出了中位數(shù)ΔCt（±標(biāo)準(zhǔn)偏差）為-3.452（±0.60），PCR效率為0.99990，R2為0.95。正是端粒（帶或不帶質(zhì)粒）qPCR的結(jié)果支持了在生成標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)比較性IFNB1寡核苷酸發(fā)夾環(huán)的形成對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響的這一基因解碼結(jié)果。

使用雙鏈DNA濃度測(cè)定法生成了一個(gè)大樣本（300μL）的0.5 ng/μL DNA稀釋液，該樣本來自唾液和全血提取的DNA，并使用表2中列出的端粒重復(fù)、比較性IFNB1和36B4 (RPLP0)單拷貝基因qPCR檢測(cè)方案進(jìn)行擴(kuò)增。這些分析的結(jié)果也在表3、表4和表5中呈現(xiàn)。表3和表4中列出的比較性IFNB1單拷貝基因的結(jié)果未顯示唾液的平均端粒長(zhǎng)度長(zhǎng)于血液白細(xì)胞。相反，使用36B4 (RPLP0)單拷貝基因的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定顯示唾液中提取的DNA相比血液白細(xì)胞DNA具有更長(zhǎng)的端粒長(zhǎng)度（表5）。表5還顯示，在使用36B4 (RPLP0)單拷貝基因時(shí)，男性（平均：4.54）比女性（平均：4.23）參與者具有更長(zhǎng)的端粒長(zhǎng)度，而使用比較性IFNB1單拷貝基因時(shí)則相反（表3、表4）。表3顯示，相比于使用比較性IFNB1單拷貝基因（兩步法）（顯示男性的端粒長(zhǎng)度長(zhǎng)于女性），使用比較性IFNB1單拷貝基因（三步法）時(shí)，女性具有更長(zhǎng)的端粒長(zhǎng)度（表4）。這些結(jié)果無論是使用相對(duì)或先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法進(jìn)行分析，都與比較性IFNB1（無質(zhì)粒）qPCR測(cè)定結(jié)果一致。

圖2. 使用沒有添加質(zhì)粒（pBR322）的三步PCR方案進(jìn)行的遺傳分析。a）端粒qPCR檢測(cè)方法，b）比較IFNB1 qPCR檢測(cè)方法。

圖3. 使用添加了質(zhì)粒（pBR322）的兩步qPCR方案進(jìn)行的遺傳分析。a）端粒qPCR檢測(cè)方法，b）比較IFNB1 qPCR檢測(cè)方法，c）替代IFNB1 qPCR檢測(cè)方法，d）36B4 qPCR檢測(cè)方法。

對(duì)比較性IFNB1測(cè)定的三步法和兩步法的解離曲線進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，無論使用哪種實(shí)驗(yàn)方案，非模板對(duì)照（NTC）樣本中均可觀察到高于背景的峰值（圖2b和3b）。比較性IFNB1單拷貝基因測(cè)定相關(guān)的擴(kuò)增曲線和解離曲線中都可以看到超過背景水平的NTC峰值。而在使用36B4 (RPLP0)單拷貝基因時(shí)，解離曲線中未觀察到NTC峰值（圖3d）。36B4 (RPLP0)單拷貝基因的擴(kuò)增曲線確實(shí)顯示了一個(gè)峰值，但該峰值的高度未超過擴(kuò)增曲線開始時(shí)的背景水平（圖3d）。

無論是否使用質(zhì)粒，評(píng)估端粒重復(fù)序列的解離曲線都顯示出非模板對(duì)照（NTC）樣本的小峰值（圖2a和3a）。無質(zhì)粒的三步法協(xié)議在解離曲線中顯示出比含質(zhì)粒的兩步法更高的NTC峰值（圖2a和3a）。此外，無論是否含質(zhì)粒，端粒重復(fù)序列的擴(kuò)增曲線也顯示出一個(gè)峰值，但含質(zhì)粒的兩步法峰值的高度不如去除質(zhì)粒并增加退火溫度時(shí)觀察到的擴(kuò)增曲線開始處的背景水平（圖2b和3b）。無論使用哪種實(shí)驗(yàn)方案，端粒區(qū)域的擴(kuò)增中還可以發(fā)現(xiàn)兩個(gè)額外的峰值。這是由于寡核苷酸與基因組DNA之間G/C序列穩(wěn)定性差異引起的多級(jí)熔解轉(zhuǎn)變。因此，產(chǎn)生具有多個(gè)峰值的熔解曲線可以視為一種成功的qPCR測(cè)定方法。
 

替代的 IFNB1 單拷貝基因 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度 分析

考慮到使用比較性 IFNB1 單拷貝基因分析時(shí)所觀察到的困難，佳學(xué)基因還測(cè)試了一種替代的 IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度 單拷貝基因分析，目標(biāo)是位于染色體9上的 IFNB1 基因的 5' UTR 區(qū)域。這種替代的 IFNB1 單拷貝基因 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度 分析針對(duì)的是與先前發(fā)表的 IFNB1 相對(duì) 端粒長(zhǎng)度 分析相似的 IFNB1 引物區(qū)域。

生物信息學(xué)分析

對(duì)于在圖1c）中展示的寡核苷酸，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。分析結(jié)果顯示，該寡核苷酸是一個(gè)82堿基對(duì)的雙鏈寡核苷酸模板，用于引物結(jié)合以生成已知二倍體拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這個(gè)雙鏈寡核苷酸的長(zhǎng)度略長(zhǎng)于36B4（RPLP0）先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析中使用的75 bp雙鏈寡核苷酸，但仍在建議的75-150 bp目標(biāo)序列長(zhǎng)度范圍內(nèi)，符合良好PCR實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。使用UCSC基因組瀏覽器的Blat搜索（Kent, 2002），對(duì)替代的IFNB1雙鏈寡核苷酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明這個(gè)82堿基對(duì)的雙鏈寡核苷酸模板只位于IFNB1基因座的染色體9p21.3位置，該區(qū)域沒有序列變異或重復(fù)區(qū)域。

圖1c）還展示了用于這種替代IFNB1單拷貝基因分析的前向和反向引物，這些引物以G/C堿基對(duì)開始和結(jié)束引物序列，從而通過GC氫鍵夾持增強(qiáng)引物的穩(wěn)定性。對(duì)替代IFNB1引物進(jìn)行的Primer-BLAST搜索顯示，這兩個(gè)引物分別為21堿基對(duì)的替代IFNB1前向引物和22堿基對(duì)的替代IFNB1反向引物，它們與這個(gè)替代IFNB1位置相結(jié)合。這兩個(gè)引物的長(zhǎng)度略短于原始先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析中使用的23 bp前向引物和25 bp反向引物，但仍然在18-24 bp的良好設(shè)計(jì)PCR協(xié)議所要求的長(zhǎng)度范圍內(nèi)。此外，前向引物的熔解溫度（Tm）為62 °C（G/C = 10 × 4; A/T = 11 × 2），而反向引物的熔解溫度（Tm）為60 °C（G/C = 8 × 4; A/T = 14 × 2）。替代IFNB1引物的熔解溫度相差不超過5 °C，并且在50 °C到60 °C之間，符合PCR實(shí)驗(yàn)方案的引物設(shè)計(jì)的要求。

Primer-Blast搜索還顯示，替代IFNB1前向引物與位于染色體20上的鋅指SWIM類型（ZSWIM3）轉(zhuǎn)錄本具有同源性。在檢查這個(gè)匹配時(shí)，發(fā)現(xiàn)這個(gè)21堿基對(duì)的前向引物將在這個(gè)開放閱讀框164（SWIM3）位置的兩個(gè)區(qū)域之間相隔1,307堿基對(duì)結(jié)合兩次。雖然在這兩個(gè)區(qū)域中IFNB1前向引物有5個(gè)核苷酸是非同源的（附圖2），但在相隔1,307個(gè)堿基的兩個(gè)區(qū)域中，擴(kuò)增會(huì)需要額外的時(shí)間在延伸步驟中進(jìn)行。由于在使用校對(duì)聚合酶時(shí)不建議使用超過推薦延伸時(shí)間，而QuantiTect SYBR Green Master Mix（Qiagen）中的Qiagen HotStarTaq DNA聚合酶是一種高保真度的熱啟動(dòng)校對(duì)酶，使用替代IFNB1前向引物擴(kuò)增額外的SWIM3區(qū)域在兩步法qPCR實(shí)驗(yàn)方案中，其中退火和延伸步驟結(jié)合在一起，會(huì)更加困難。因此，佳學(xué)基因認(rèn)為替代IFNB1前向和反向引物只會(huì)結(jié)合并擴(kuò)增其指定的位置，如圖1c)所示，并且不會(huì)結(jié)合到基因組的任何其他區(qū)域或任何其他基因組位置。

為了測(cè)試替代IFNB1 qPCR方案的生物信息學(xué)評(píng)估正確性，進(jìn)行了另一項(xiàng)遺傳學(xué)分析，如表2所示。該遺傳學(xué)分析使用了與36B4 (RPLP0)相似的兩步法，在60 °C退火的條件下進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，以創(chuàng)建替代IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用替代IFNB1寡核苷酸稀釋的10倍稀釋物獲得的平均Ct值反映了每個(gè)PCR循環(huán)中寡核苷酸模板的兩倍增加，通過獲得ΔCt均值（± SD）為-3.60（±0.22）個(gè)周期數(shù)（表6），表明斜率在-3.1和-3.6之間，通常適用于大多數(shù)需要正確定量的應(yīng)用。替代IFNB1擴(kuò)增的PCR效率也為0.9或90%，R2為0.99942（表6）。

表6：使用替代IFNB1（兩步法）qPCR方案計(jì)算端粒長(zhǎng)度（含質(zhì)粒）。

對(duì)替代IFNB1 qPCR方案的解離曲線進(jìn)行評(píng)估顯示，在非模板對(duì)照（NTC）樣本中存在一個(gè)峰值（圖3c）。與36B4（RPLP0）單拷貝基因類似，替代IFNB1單拷貝基因的擴(kuò)增曲線顯示該峰值不超過擴(kuò)增曲線開始時(shí)的背景水平，因此在解離曲線中沒有顯示出來（圖3c）。

使用替代IFNB1單拷貝基因的qPCR生成的端粒長(zhǎng)度結(jié)果是使用與36B4（RPLP0）qPCR分析相同的0.5 ng/uL唾液和全血DNA的子樣進(jìn)行的（表5）。表6列出的端粒長(zhǎng)度結(jié)果顯示，與血液DNA相比，從唾液中提取的DNA在使用替代IFNB1單拷貝基因時(shí)具有更長(zhǎng)的平均端粒長(zhǎng)度。表6還顯示，當(dāng)使用替代IFNB1單拷貝基因分析時(shí)，男性（平均值：6.34）比女性（平均值：5.69）參與者具有更長(zhǎng)的端粒長(zhǎng)度。

為了展示使用替代IFNB1 qPCR方案作為單拷貝基因的重復(fù)性，佳學(xué)基因再次分析了來自另外一名女性和男性參與者的唾液和全血DNA樣本，將分析樣本的數(shù)量增加到15名參與者，并計(jì)算了ICC值進(jìn)行重新分析。分析這些結(jié)果（CI = 0.90）顯示該檢測(cè)具有良好的重復(fù)性，獲得相對(duì)端粒長(zhǎng)度分析的ICC（±SD）為0.936（±0.06），先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法的ICC（±SD）為0.897（±0.09）（CI 0.90）（表7）。佳學(xué)基因還繪制了年齡與先進(jìn)端粒長(zhǎng)度結(jié)果之間的相關(guān)性散點(diǎn)圖。賊佳擬合線顯示了年齡與先進(jìn)端粒長(zhǎng)度結(jié)果之間的反向關(guān)系。該單拷貝基因檢測(cè)能夠顯示年齡較小的參與者具有較長(zhǎng)的端粒長(zhǎng)度，而年齡較大的參與者則具有較短的端粒長(zhǎng)度（圖4）。

表7. 使用含質(zhì)粒的替代IFNB1（兩步）qPCR方案進(jìn)行的重復(fù)性研究

(a) 進(jìn)行端粒和替代IFNB1 qPCR檢測(cè)的先進(jìn)批結(jié)果

(b) 進(jìn)行端粒和替代IFNB1 qPCR檢測(cè)的第二批結(jié)果。

圖4. 使用替代IFNB1單拷貝基因進(jìn)行先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析的年齡和端粒長(zhǎng)度（端粒長(zhǎng)度）的散點(diǎn)圖。

佳學(xué)基因年輕態(tài)基因檢測(cè)的方法學(xué)分析

IFNB1基因在人類和小鼠中僅編碼一個(gè)基因。曾引入了針對(duì)IFNB1的單拷貝基因修飾，用于使用相對(duì)端粒長(zhǎng)度 qPCR分析測(cè)量端粒長(zhǎng)度。其他相對(duì)端粒長(zhǎng)度的研究發(fā)表后也采用了該IFNB1 qPCR方法來獲得相對(duì)端粒長(zhǎng)度結(jié)果。相反，在先進(jìn)端粒長(zhǎng)度（先進(jìn)端粒長(zhǎng)度）qPCR分析中使用IFNB1作為單拷貝基因的結(jié)果一直缺乏，直到佳學(xué)基因所進(jìn)行一項(xiàng)比較研究現(xiàn)，在兒童隊(duì)列中的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度和DNAm端粒長(zhǎng)度端粒長(zhǎng)度結(jié)果之間存在不一致。

佳學(xué)基因的細(xì)胞年輕態(tài)端?；驒z測(cè)方法學(xué)比較指出了幾個(gè)可能的原因。佳學(xué)基因的比較研究選擇了Qiagen HotStarTaq DNA聚合酶，該酶存在于QuantiTect SYBR Green Master Mix（Qiagen）中，用于更長(zhǎng)的延伸時(shí)間和選擇三步qPCR方案來比較先進(jìn)端粒長(zhǎng)度和DNAm端粒長(zhǎng)度分析中的端粒長(zhǎng)度。鑒于使用證據(jù)酶時(shí)不建議超過推薦的延伸時(shí)間，因此在比較的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度研究中選擇了這種酶用于三步PCR程序。先前的研究也指出，與三步PCR方案相比，兩步PCR方案更適合擴(kuò)增短串聯(lián)重復(fù)序列，例如端粒重復(fù)區(qū)域。

端粒長(zhǎng)度的結(jié)果在比較IFBNB1和DNAm端粒長(zhǎng)度研究之間的不一致可能還源于在生成標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)未包括圓形雙鏈DNA質(zhì)粒（pBR322），以維持每個(gè)反應(yīng)管中總DNA的恒定量。去除這種循環(huán)DNA將改變DNA模板濃度，從而改變其鎖定的鎂離子濃度（Henegariu et al., 1997）。鎂是熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶高效工作所必需的輔因子（Altshulder, 2006）。本研究的結(jié)果顯示，去除圓形質(zhì)粒DNA來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線可能會(huì)導(dǎo)致QuantiTect SYBR Green Master Mix（Qiagen）中游離鎂離子濃度的增加，降低高保真HotstarTaq DNA聚合酶的正確性，從而增加非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)量（Altshulder, 2006）。這在端粒重復(fù)序列qPCR分析的NTC樣本中表現(xiàn)得賊為明顯，其中在擴(kuò)增曲線中觀察到了非特異性產(chǎn)物的輕微增加，以及三步端粒重復(fù)序列qPCR方案的解離曲線中的峰值（Fig. 2b和3b）。然而，通過去除圓形質(zhì)粒DNA來改變鎂離子濃度似乎不會(huì)影響比較IFNB1單拷貝基因qPCR分析中NTC樣本中引物二聚體形成或誤引物結(jié)合的概率。無論是否使用兩步或三步方案進(jìn)行qPCR分析，該NTC樣本的解離曲線中都可以觀察到與已測(cè)試樣本高度相等的峰值，而不受質(zhì)粒狀態(tài)的影響（Fig. 2b和3b）。

因此，可以假設(shè)在比較IFNB1 qPCR分析中生成了兩個(gè)以上的目標(biāo)序列拷貝。對(duì)比IFNB1引物和寡核苷酸分析的生物信息學(xué)結(jié)果（Hastings等人，2022）進(jìn)一步說明了導(dǎo)致比較IFNB1研究中產(chǎn)生兩個(gè)以上拷貝的原因。生物信息學(xué)結(jié)果顯示，在比較IFNB1前向引物的末端發(fā)現(xiàn)的二核苷酸重復(fù)可能導(dǎo)致與反義寡核苷酸中的非同源結(jié)合，從而生成比較IFNB1前向引物的非特異性引物，如圖1a所示。通過添加5個(gè)堿基以匹配真實(shí)位置，將在正義寡核苷酸鏈上與前向引物非特異性結(jié)合的二核苷酸重復(fù)生成一個(gè)34堿基的非特異性引物產(chǎn)物，其中前向引物在反義寡核苷酸中間的二核苷酸重復(fù)位置非特異性結(jié)合，并懸掛了21堿基。無論使用兩步還是三步qPCR協(xié)議，都會(huì)在NTC樣本的解離曲線中產(chǎn)生熔解曲線，如圖2b和3b所示。

此外，對(duì)比IFNB1 qPCR寡核苷酸的生物信息學(xué)分析顯示形成了發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，這可能限制反義寡核苷酸濃度的擴(kuò)增，并導(dǎo)致比較IFNB1熔解曲線（圖2b和3b）中的峰值高度較36B4（RPLP0）熔解曲線（圖3d）低。比較IFNB1寡核苷酸的濃度減少，無論是否添加pBR322質(zhì)粒，都將導(dǎo)致全血和唾液DNA樣本的位置偏離其相應(yīng)的比較IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線區(qū)域，如圖2b和3b所示。由于發(fā)夾環(huán)的形成（圖1b），進(jìn)一步稀釋比較IFNB1寡核苷酸濃度來構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，即使進(jìn)行額外的PCR循環(huán)，也不會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物翻倍。比較IFNB1前向引物與二核苷酸重復(fù)末端的非特異性引物形成（圖1a）還阻止了100%的PCR效率。因此，為了避免稀釋樣本中出現(xiàn)隨機(jī)效應(yīng)（https://biosistemika.com/blog/qpcr-efficiency-over-100/）并確保被測(cè)試的DNA樣本位于比較IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，比較IFNB1寡核苷酸和被測(cè)試樣本的DNA濃度需要更高。這種增加寡核苷酸濃度的需求與36B4（RPLP0）先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析中的情況類似，導(dǎo)致擴(kuò)增曲線向較低的Ct值偏移。

本研究中比較IFNB1 先進(jìn)端粒長(zhǎng)度無質(zhì)粒的PCR效率為2.33（或233％），與Hastings等人（2022）研究中列出的端粒和單拷貝基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的可接受PCR效率為1.8到2.0（10％變異）類似，相當(dāng)于180-200％。由于期望的PCR效率范圍在90％至110％之間，理論上的賊大值為100％，表示DNA聚合酶正以賊大效率工作（https://biosistemika.com/blog/qpcr-efficiency-over-100/），而180-200％的更高效率表明每個(gè)比較IFNB1 qPCR循環(huán)產(chǎn)生超過兩個(gè)目標(biāo)序列的拷貝（Table 3）。每個(gè)PCR循環(huán)中產(chǎn)生超過兩個(gè)拷貝可能會(huì)導(dǎo)致為每個(gè)比較IFNB1寡核苷酸稀釋計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)的更高ΔCt平均值。正如Hastings等人（2022）的比較IFNB1單拷貝（ΔCt平均值=-1.91）所示（表3）。這種過高估計(jì)的二倍體拷貝數(shù)將導(dǎo)致對(duì)于使用比較IFNB1 qPCR方法時(shí)將過高估計(jì)的二倍體拷貝數(shù)除以端粒重復(fù)數(shù)來計(jì)算任何被測(cè)試樣本的真實(shí)端粒長(zhǎng)度時(shí)的低估或縮短。在本研究中，使用比較IFNB1單拷貝基因qPCR分析得出的端粒長(zhǎng)度結(jié)果，無論使用哪種端粒長(zhǎng)度方法，與比較IFNB1單拷貝基因（兩步）qPCR分析相比，女性和男性參與者的平均端粒長(zhǎng)度較低（表2，表3）。端粒長(zhǎng)度的增加可能是由于端粒重復(fù)qPCR分析中非特異性引物在背景上方的減少，從而使得每個(gè)樣本中的端粒重復(fù)數(shù)增加能夠被檢測(cè)到。值得注意的是，本研究中使用的36B4（RPLP0）單拷貝基因qPCR分析也導(dǎo)致了樣本中的端粒長(zhǎng)度較低。無論是否添加質(zhì)?；蜻x擇哪種PCR協(xié)議，使用比較IFNB1單拷貝基因qPCR會(huì)過高估計(jì)二倍體拷貝數(shù)，這也可以解釋與使用DNAm端粒長(zhǎng)度方法生成的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度結(jié)果進(jìn)行比較時(shí)未發(fā)現(xiàn)的結(jié)果（Hastings等人，2022）。此外，由于36B4（RPLP0）已被證明是一個(gè)具有多個(gè)位置的假基因，在每個(gè)PCR循環(huán)中其拷貝模板將有更大的翻倍。這在通過先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析生成的端粒長(zhǎng)度低于使用比較IFNB1 qPCR時(shí)得到的端粒長(zhǎng)度中得到證明。

表3和表4中列出的比較IFNB1單拷貝基因的結(jié)果并未顯示任何特定細(xì)胞類型的端粒長(zhǎng)度較其他細(xì)胞類型更長(zhǎng)。相反，表5顯示從唾液中提取的DNA相較于血液中的DNA具有更長(zhǎng)的端粒長(zhǎng)度。表5還顯示，與使用比較IFNB1單拷貝基因相比，使用36B4（RPLP0）單拷貝基因時(shí)，女性和男性參與者的端粒長(zhǎng)度較長(zhǎng)（表3，表4）。然而，表3顯示，與使用比較IFNB1單拷貝基因（兩步）相比，女性和男性在使用比較IFNB1單拷貝基因（三步）時(shí)的端粒長(zhǎng)度較長(zhǎng)。這些結(jié)果無論是使用相對(duì)端粒長(zhǎng)度方法還是先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法進(jìn)行分析都是一致的。需要注意的是，由于樣本數(shù)量較小，對(duì)這些結(jié)果應(yīng)謹(jǐn)慎解讀。 生物信息學(xué)和遺傳學(xué)結(jié)果的累積證據(jù)表明，比較IFNB1單拷貝基因分析與36B4（RPLP0）單拷貝基因分析在為先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析提供正確的二倍體拷貝數(shù)評(píng)估方面相似，這提供了一個(gè)合理的解釋，為什么比較IFNB1的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度分析結(jié)果與DNAm端粒長(zhǎng)度結(jié)果不相關(guān)（Hastings等人，2022）。

因此，佳學(xué)基因提出了一種替代的IFNB1單拷貝基因測(cè)定方法，用作先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法的單拷貝基因測(cè)定方法。將替代IFNB1單拷貝基因的擴(kuò)增和解離曲線與比較IFNB1和36B4（RPLP0）單拷貝基因所獲得的曲線進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在替代IFNB1單拷貝基因測(cè)定中，NTC中沒有產(chǎn)生非特異性引物擴(kuò)增。替代IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果的一致性將真實(shí)反映端粒長(zhǎng)度，當(dāng)將計(jì)算得到的二倍體拷貝數(shù)除以每個(gè)測(cè)試樣品的端粒重復(fù)序列時(shí)，不會(huì)延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度。實(shí)際上，佳學(xué)基因端?；驒z測(cè)先進(jìn)端粒長(zhǎng)度結(jié)果的散點(diǎn)圖顯示了年齡與端粒長(zhǎng)度之間預(yù)期的反向關(guān)系，即端粒長(zhǎng)度隨年齡減少（圖4）。為了展示這種單拷貝基因測(cè)定作為可重復(fù)使用的方法，佳學(xué)基因再次分析了來自額外的女性和男性參與者的唾液和全血樣品，使得樣品數(shù)達(dá)到了15個(gè)參與者。對(duì)這些結(jié)果的分析顯示，該測(cè)定提供了相對(duì)端粒長(zhǎng)度分析的ICCs（± SD）為0.936（± 0.06）（CI 0.90），先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法的ICC（± SD）為0.897（± 0.09）（CI 0.90）。替代IFNB1單拷貝基因先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定的優(yōu)勢(shì)在于能夠提供一個(gè)中位數(shù)ΔCt值為-3.60的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相當(dāng)于每個(gè)PCR循環(huán)中的拷貝數(shù)增加兩倍，反應(yīng)效率為90%。這對(duì)于大多數(shù)需要正確定量的應(yīng)用來說是可接受的。比較IFNB1單拷貝基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線無論使用何種PCR基因檢測(cè)，都未反映出這種可接受的拷貝數(shù)增加兩倍，每個(gè)周期都如此（表3）。當(dāng)使用替代IFNB1標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，10倍稀釋的拷貝基因濃度始終能提供更高的二倍體拷貝數(shù)，從而真實(shí)反映出先進(jìn)端粒長(zhǎng)度，而在計(jì)算得到的二倍體拷貝數(shù)除以每個(gè)測(cè)試樣品的端粒重復(fù)序列時(shí)不會(huì)延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度。定量PCR分析的一個(gè)限制在于所選擇的熒光檢測(cè)模式。使用SYBR Green和雙標(biāo)記熒光（Taqman）方法是賊常用的兩種定量PCR方法。佳學(xué)基因開發(fā)的原始qPCR端粒長(zhǎng)度方法使用SYBR Green測(cè)量TTAGGG端粒重復(fù)序列的擴(kuò)增中的熒光。佳學(xué)基因解碼開發(fā)的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度方法繼續(xù)使用SYBR Green捕獲端粒重復(fù)序列和單拷貝基因的雙鏈DNA擴(kuò)增，以避免改變兩種qPCR測(cè)定的運(yùn)行條件。SYBR Green比Taqman更便宜，但可能也會(huì)檢測(cè)到端粒區(qū)域的非特異性產(chǎn)物。佳學(xué)基因端粒基因檢測(cè)比較了SYBR Green和Taqman方法在四種腺苷受體亞型的實(shí)時(shí)定量PCR分析中的應(yīng)用，并發(fā)現(xiàn)在使用高性能引物和適當(dāng)?shù)膮f(xié)議時(shí)，兩種檢測(cè)方法都能產(chǎn)生正確的數(shù)據(jù)。佳學(xué)基因使用的替代IFNB1 qPCR研究通過在NTC樣品中使用端粒和替代IFNB1單拷貝基因引物來獲得無引物二聚體擴(kuò)增并達(dá)到閾值，也提供了良好高效的ICC結(jié)果。因此，佳學(xué)基因檢測(cè)的結(jié)果支持觀察到端粒重復(fù)序列和替代IFNB1單拷貝基因qPCR測(cè)定中有限的非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。佳學(xué)基因檢測(cè)驗(yàn)證了之前的比較研究中顯示的比較IFNB1單拷貝基因所獲得的端粒結(jié)果與使用DNAm端粒長(zhǎng)度方法獲得的結(jié)果之間的不一致性。佳學(xué)基因解決了比較IFNB1單拷貝基因qPCR測(cè)定設(shè)計(jì)問題。佳學(xué)基因檢測(cè)提出的替代IFNB1單拷貝基因測(cè)定方法不存在其他基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)存的在的任何問題，并顯示出真正的單拷貝基因測(cè)定。任何進(jìn)一步實(shí)施這種替代IFNB1單拷貝基因測(cè)定方法的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度測(cè)定將避免與進(jìn)一步的端粒長(zhǎng)度比較研究存在任何差異，并減少使用不同端粒長(zhǎng)度方法進(jìn)行的不同研究之間的先進(jìn)端粒長(zhǎng)度結(jié)果的挑戰(zhàn)。